對(duì)利福平與異煙肼多個(gè)基因耐藥初治結(jié)核病1例報(bào)告

秦萬(wàn) 歐維正 蒙俊 羅志穎 駱科文 王燕

（貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng)550006）

結(jié)核耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，包括結(jié)核菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成變化、結(jié)核菌自身的藥物外排泵系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)藥物靶編碼基因發(fā)生突變［1］。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)藥物基因檢測(cè)試驗(yàn)不斷進(jìn)步，藥敏檢測(cè)的時(shí)間大大縮短，而且還可精確到某個(gè)基因。我院首次發(fā)現(xiàn)1例初治結(jié)核患者對(duì)利福平（RFP）與異煙肼（INH）的3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB基因、katG基因及inhA基因都有耐藥性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者，男，42歲，無(wú)業(yè)。既往史，10年前因“膽結(jié)石”行“膽囊切除術(shù)”（具體不詳），個(gè)人史，生長(zhǎng)于原籍，否認(rèn)疫區(qū)久居史，吸煙20＋年，每天20支，飲酒20＋年，2～3次／周，每次500g左右。于2014年11月10日門診入院，2014年11月13日出院，住院號(hào)，1408258；入院前治療情況，2014年4月予抗癆治療至今。但治療情況較差，患者仍有咳嗽、嘔血、體質(zhì)量減輕等臨床癥狀。入院后檢查項(xiàng)目及結(jié)果：胸部CT示雙肺彌漫條射、斑點(diǎn)影、右上葉多發(fā)不規(guī)則空洞影、大部分病灶邊緣清晰、右上葉部分支氣管狹窄閉塞、肺門縱膈未見腫大淋巴結(jié)、右側(cè)局部胸膜反應(yīng)增厚、雙側(cè)未見胸腔積液。痰抗酸染色示陽(yáng)性；痰分支桿菌核酸檢測(cè)示陽(yáng)性；基因芯片法藥敏試驗(yàn)示RFP與INH均耐藥；比例法藥敏提示利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素均耐藥，氧氟沙星與卡拉霉素敏感。血常規(guī)，中性粒細(xì)胞百分比79.60偏高，余正常；血?dú)狻㈦娊赓|(zhì)、肝功能未見異常；血沉：63mm／h偏高；尿常規(guī)：尿糖＋1，余正常；血糖15.40mmol／L。入院診斷：繼發(fā)性肺結(jié)核，初治多重耐藥結(jié)核（MDR－TB）。

1.2 檢測(cè)方法 PCR－熒光探針?lè)ㄌ崛『怂幔换蛐酒z測(cè)耐藥基因，檢測(cè)指標(biāo)包括RFP及INH的3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB基因、katG基因及inhA基因啟動(dòng)子的野生型及不同突變型。其中RFP耐藥相關(guān)基因rpoB基因檢測(cè)6個(gè)位點(diǎn)，包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等13種突變型，對(duì)于INH耐藥相關(guān)基因katG基因及inhA基因啟動(dòng)子各檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn)，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC兩個(gè)突變型，inhA基因啟動(dòng)子－15位C→T突變型；液化液10%NaOH由實(shí)驗(yàn)室自行配制；核酸提取洗滌液用無(wú)菌生理鹽水或PCR－熒光探針?lè)z測(cè)試劑盒配裝；芯片洗滌液按DNA基因芯片試劑盒配裝要求自行配制。儀器：95℃K30干式恒溫器（恒溫金屬浴）由上海之信儀器有限公司提供；ExtractorTM36核酸快速提取儀由博奧生物有限公司提供；ABI 7300PCR儀由ABI公司提供；TC－96／G／H（b）生命快車基因擴(kuò)增儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、SlideWasherTM8芯片洗干儀、LuxScan10K－B微陣列芯片掃描儀均由博奧生物有限公司提供。質(zhì)量控制：本試劑盒陽(yáng)性對(duì)照品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為“rpoB野生型”、“katG野生型”及“inhA野生型”；陰性對(duì)照品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為“無(wú)結(jié)核分枝桿菌”。如果其中任何一個(gè)對(duì)照品結(jié)果錯(cuò)誤，則同一次實(shí)驗(yàn)全部樣品結(jié)果定為無(wú)效，需要進(jìn)行復(fù)檢。

2 結(jié) 果

RFP：rpoB 511（T－C）突變型，rpoB 516（A－G）突變型被檢者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)與利福平耐藥相關(guān)的基因突變，該菌株對(duì)利福平耐藥。INH：katG 315（G－C）突變型，inhA－15（C－T）突變型被檢者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)與異煙肼耐藥相關(guān)的基因突變，該菌株對(duì)異煙肼耐藥。

3 討 論

結(jié)核病疫情惡化的原因之一是MDR－TB的出現(xiàn)和流行［2］。自從我院PCR實(shí)驗(yàn)室建立兩年多來(lái)對(duì)RFP與INH3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB基因、katG基因及inhA基因的耐藥檢測(cè)以來(lái)，對(duì)rpoB基因、katG基因耐藥的比較常見，而對(duì)inhA基因耐藥的比較少見。除此之外，對(duì)rpoB基因耐藥的一般都是以某一個(gè)基因點(diǎn)耐藥比較多見，而對(duì)兩個(gè)以上基因點(diǎn)都耐藥的并不多見，而同時(shí)對(duì)3個(gè)耐藥相關(guān)基因都耐藥的又極少見。故對(duì)該病例進(jìn)行詳細(xì)討論。在實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐中，RFP rpoB基因的耐藥率比較高，這可能是與突變的相對(duì)集中，探針設(shè)計(jì)的合理有關(guān)，INH katG基因及inhA基因耐藥檢出率較低些，未檢出的樣品可能是由于它的突變類型在本檢測(cè)膜芯片設(shè)計(jì)的探針之外，或者產(chǎn)生耐藥的突變基因不是katG基因和inhA基因。從以上該患者的臨床資料可知，該患者每天吸煙和每周飲酒的量都特別大，而且時(shí)間也比較長(zhǎng)，因此這些都有可能與他初治的結(jié)核藥產(chǎn)生耐藥有關(guān)。因?yàn)殚L(zhǎng)期過(guò)量飲酒或吸煙都有可能會(huì)改變自身免疫性下降，以致耐藥性的產(chǎn)生。而從檢測(cè)的結(jié)果還可看出，該患者對(duì)RFPrpoB基因耐藥有兩個(gè)基因點(diǎn)；對(duì)INHkatG基因及inhA基因都耐藥，即對(duì)RFP與INH有多個(gè)耐藥基因產(chǎn)生。此外，由于基因芯片法試劑盒本身的局限性，即其檢測(cè)的基因位點(diǎn)僅用于RFP與INH耐藥性的定性檢測(cè)，同時(shí)還有未完全包括結(jié)核分支桿菌耐藥基因突變位點(diǎn)，故此患者對(duì)RFP與INH的耐藥點(diǎn)是否還有其他的耐藥基因點(diǎn)，還有待此技術(shù)的不斷提高和完善來(lái)證明。從以上臨床資料還可知該患者除了對(duì)RFP與INH耐藥外，還對(duì)鏈霉素和乙胺丁醇都有耐藥，故之前予以HRZE抗癆治療效果依然欠佳，該患者是一個(gè)典型的初治耐多藥結(jié)核者。也許還對(duì)其他抗癆藥耐藥，由于我院條件限制，其他抗結(jié)核藥還未開展。因此，應(yīng)用基因芯片快速檢出rpoB基因、katG基因及inhA基因突變可以作為耐多藥結(jié)核病的診斷指標(biāo)［3］。在此筆者建議初治的結(jié)核患者如果一旦確診為結(jié)核，就應(yīng)該到專科的結(jié)核病醫(yī)院就診，快速的檢測(cè)其耐藥篩選情況，盡早制定出科學(xué)有效的治療方案，以便得到規(guī)范的治療和病情的控制。

［1］ 閆雪梅，張朝霞.結(jié)核分支桿菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，2（35）：249.

［2］ 歐維正，駱科文，王燕，等.基因芯片和比例法藥敏性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分支桿菌對(duì)利福平和異煙肼耐藥性的比較研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，5（28）：406.

［3］ 張俊仙，吳雪瓊，陽(yáng)幼榮，等.應(yīng)用基因芯片方法檢測(cè)結(jié)核分支桿菌利福平和異煙肼的耐藥性［J］.中國(guó)防癆雜志，2011，33（10）：684.