對利福平與異煙肼多個基因耐藥初治結核病1例報告

秦萬 歐維正 蒙俊 羅志穎 駱科文 王燕

（貴陽市公共衛生救治中心檢驗科，貴州貴陽550006）

結核耐藥機制十分復雜，包括結核菌細胞壁結構與組成變化、結核菌自身的藥物外排泵系統、結構藥物靶編碼基因發生突變［1］。隨著分子生物學檢測技術的快速發展，對藥物基因檢測試驗不斷進步，藥敏檢測的時間大大縮短，而且還可精確到某個基因。我院首次發現1例初治結核患者對利福平（RFP）與異煙肼（INH）的3個耐藥相關基因rpoB基因、katG基因及inhA基因都有耐藥性?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者，男，42歲，無業。既往史，10年前因“膽結石”行“膽囊切除術”（具體不詳），個人史，生長于原籍，否認疫區久居史，吸煙20＋年，每天20支，飲酒20＋年，2～3次／周，每次500g左右。于2014年11月10日門診入院，2014年11月13日出院，住院號，1408258；入院前治療情況，2014年4月予抗癆治療至今。但治療情況較差，患者仍有咳嗽、嘔血、體質量減輕等臨床癥狀。入院后檢查項目及結果：胸部CT示雙肺彌漫條射、斑點影、右上葉多發不規則空洞影、大部分病灶邊緣清晰、右上葉部分支氣管狹窄閉塞、肺門縱膈未見腫大淋巴結、右側局部胸膜反應增厚、雙側未見胸腔積液。痰抗酸染色示陽性；痰分支桿菌核酸檢測示陽性；基因芯片法藥敏試驗示RFP與INH均耐藥；比例法藥敏提示利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素均耐藥，氧氟沙星與卡拉霉素敏感。血常規，中性粒細胞百分比79.60偏高，余正常；血氣、電解質、肝功能未見異常；血沉：63mm／h偏高；尿常規：尿糖＋1，余正常；血糖15.40mmol／L。入院診斷：繼發性肺結核，初治多重耐藥結核（MDR－TB）。

1.2 檢測方法 PCR－熒光探針法提取核酸；基因芯片法檢測耐藥基因，檢測指標包括RFP及INH的3個耐藥相關基因rpoB基因、katG基因及inhA基因啟動子的野生型及不同突變型。其中RFP耐藥相關基因rpoB基因檢測6個位點，包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等13種突變型，對于INH耐藥相關基因katG基因及inhA基因啟動子各檢測1個位點，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC兩個突變型，inhA基因啟動子－15位C→T突變型；液化液10%NaOH由實驗室自行配制；核酸提取洗滌液用無菌生理鹽水或PCR－熒光探針法檢測試劑盒配裝；芯片洗滌液按DNA基因芯片試劑盒配裝要求自行配制。儀器：95℃K30干式恒溫器（恒溫金屬浴）由上海之信儀器有限公司提供；ExtractorTM36核酸快速提取儀由博奧生物有限公司提供；ABI 7300PCR儀由ABI公司提供；TC－96／G／H（b）生命快車基因擴增儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、SlideWasherTM8芯片洗干儀、LuxScan10K－B微陣列芯片掃描儀均由博奧生物有限公司提供。質量控制：本試劑盒陽性對照品的檢測結果應為“rpoB野生型”、“katG野生型”及“inhA野生型”；陰性對照品的檢測結果應為“無結核分枝桿菌”。如果其中任何一個對照品結果錯誤，則同一次實驗全部樣品結果定為無效，需要進行復檢。

2 結 果

RFP：rpoB 511（T－C）突變型，rpoB 516（A－G）突變型被檢者標本發現與利福平耐藥相關的基因突變，該菌株對利福平耐藥。INH：katG 315（G－C）突變型，inhA－15（C－T）突變型被檢者標本發現與異煙肼耐藥相關的基因突變，該菌株對異煙肼耐藥。

3 討 論

結核病疫情惡化的原因之一是MDR－TB的出現和流行［2］。自從我院PCR實驗室建立兩年多來對RFP與INH3個耐藥相關基因rpoB基因、katG基因及inhA基因的耐藥檢測以來，對rpoB基因、katG基因耐藥的比較常見，而對inhA基因耐藥的比較少見。除此之外，對rpoB基因耐藥的一般都是以某一個基因點耐藥比較多見，而對兩個以上基因點都耐藥的并不多見，而同時對3個耐藥相關基因都耐藥的又極少見。故對該病例進行詳細討論。在實驗的實踐中，RFP rpoB基因的耐藥率比較高，這可能是與突變的相對集中，探針設計的合理有關，INH katG基因及inhA基因耐藥檢出率較低些，未檢出的樣品可能是由于它的突變類型在本檢測膜芯片設計的探針之外，或者產生耐藥的突變基因不是katG基因和inhA基因。從以上該患者的臨床資料可知，該患者每天吸煙和每周飲酒的量都特別大，而且時間也比較長，因此這些都有可能與他初治的結核藥產生耐藥有關。因為長期過量飲酒或吸煙都有可能會改變自身免疫性下降，以致耐藥性的產生。而從檢測的結果還可看出，該患者對RFPrpoB基因耐藥有兩個基因點；對INHkatG基因及inhA基因都耐藥，即對RFP與INH有多個耐藥基因產生。此外，由于基因芯片法試劑盒本身的局限性，即其檢測的基因位點僅用于RFP與INH耐藥性的定性檢測，同時還有未完全包括結核分支桿菌耐藥基因突變位點，故此患者對RFP與INH的耐藥點是否還有其他的耐藥基因點，還有待此技術的不斷提高和完善來證明。從以上臨床資料還可知該患者除了對RFP與INH耐藥外，還對鏈霉素和乙胺丁醇都有耐藥，故之前予以HRZE抗癆治療效果依然欠佳，該患者是一個典型的初治耐多藥結核者。也許還對其他抗癆藥耐藥，由于我院條件限制，其他抗結核藥還未開展。因此，應用基因芯片快速檢出rpoB基因、katG基因及inhA基因突變可以作為耐多藥結核病的診斷指標［3］。在此筆者建議初治的結核患者如果一旦確診為結核，就應該到專科的結核病醫院就診，快速的檢測其耐藥篩選情況，盡早制定出科學有效的治療方案，以便得到規范的治療和病情的控制。

［1］ 閆雪梅，張朝霞.結核分支桿菌耐藥機制研究進展［J］.新疆醫科大學學報，2012，2（35）：249.

［2］ 歐維正，駱科文，王燕，等.基因芯片和比例法藥敏性試驗檢測結核分支桿菌對利福平和異煙肼耐藥性的比較研究［J］.檢驗醫學，2013，5（28）：406.

［3］ 張俊仙，吳雪瓊，陽幼榮，等.應用基因芯片方法檢測結核分支桿菌利福平和異煙肼的耐藥性［J］.中國防癆雜志，2011，33（10）：684.