黃芩苷對ApoE基因敲除小鼠早期動脈粥樣斑塊中MMP-9表達的影響*

劉小軍 萬招飛 王新宏 趙 娜 袁祖貽

西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科(西安710061)

·論著·基礎研究·

黃芩苷對ApoE基因敲除小鼠早期動脈粥樣斑塊中MMP-9表達的影響*

劉小軍 萬招飛 王新宏△趙 娜▲袁祖貽#

西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科(西安710061)

目的： 探討黃芩苷對ApoE基因敲除小鼠早期動脈粥樣斑塊中基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達的影響。方法： 24只8周齡ApoE -/-小鼠均給予高脂飼料喂養8周后隨機分為對照組、苷低劑量和高劑量組，每組8只。灌胃8周后處死，酶法檢測血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度；用ELISA測血清中MMP-9的表達水平;通過RT-PCR和 Western blot檢測小鼠主動脈斑塊組織中MMP-9的表達情況。結果： 與對照組相比，干預組小鼠血清中TC水平降低(P<0.05), 血清中LDL-C水平明顯降低(P<0.01)，高劑量組較低劑量組降低的明顯(P<0.05)；各組小鼠血清中HDL-C及TG含量雖有變化但無統計學意義。黃芩苷干預組血清MMP-9較對照組表達水平低，高劑量組降低更顯著(P<0.05)；同時，黃芩苷干預組主動脈斑塊中MMP-9 mRNA及蛋白水平較對照組降低明顯(P<0.01)，高劑量組降低尤為顯著(P<0.05)。結論： 黃芩苷可以降低ApoE -/-小鼠血清中血脂和MMP-9水平，并可降低動脈粥樣硬化斑塊中MMP-9表達，提示黃芩苷具有穩定動脈粥樣硬化斑塊作用。

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種以脂質聚集和炎性細胞浸潤為特征的慢性炎癥過程，動脈粥樣硬化斑塊不穩定或破裂可導致急性心腦血管事件如心梗、卒中等的發生[1]。基質金屬蛋白酶作為一類可以降解細胞外基質的蛋白酶，參與血管管壁基質的降解，促使炎性細胞浸潤及斑塊的不穩定[2]。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是基質金屬蛋白酶重要成員之一，與As 斑塊穩定性尤為相關[3,4]。黃芩作為傳統中藥，在心血管疾病中有很重要的藥用價值。黃芩苷(Baicalin)是由黃芩干燥根中提取一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一。既往研究發現黃芩苷具抗氧化、抑制血管平滑肌細胞增殖、抗炎等作用[5～8]。本研究以apoE -/-小鼠為動物模型，觀察黃芩苷對血清中及主動脈斑塊MMP-9表達的影響，探討黃芩苷在穩定AS早期動脈粥樣硬化斑塊中的作用。

材料和方法

1 藥品和儀器 黃芩苷：四川廣漢植化公司，相對分子質量446，純度98.5%，用生理鹽水配制成 25 mg/ml，加1mol/ml NaOH調節pH值到7.3～7.4于密閉棕色容器中儲存。甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)生化試劑盒(浙江東鷗生物工程有限公司)；RNA提取試劑 Trizol購自Invitrongen公司Step One Real-Time PCR System 美國ABI公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesisi Kit逆轉錄試劑盒為Fermentas公司，SYBRGreen購自Roche公司；MMP-9兔抗鼠一抗及MMP-9 ELESLL試劑盒均為(Santa Cruz Biotechnology公司)，HRP-山羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物技術公司)。

2 實驗動物分組及給藥方式 24只C57BL/6J遺傳背景的ApoE -/-小鼠，8周齡，體重20±1.5g，雄性，購自中國南京大學模式動物遺傳研究中心，所有動物均飼養于西安交通大學醫學院實驗動物中心層流室(sPF級屏障環境)。高脂喂養8周后,隨機分為3組，即對照組、黃芩苷低劑量組和高劑量組，每組8只。黃芩苷低劑量組和高劑量組分別給予25、 50mg/kg·d黃芩苷，對照組則給予生理鹽水。每天定時灌胃1次，連續灌胃周期8w。

3 標本制備 每組小鼠空腹過夜，晨起摘除眼球采4℃ 3000r離心10min分離血清儲存于-80℃待檢。采血后迅速開胸，右心耳行小切口，左室插管，用無菌冰生理鹽水灌注循環，直至灌洗液清亮，直視下分離主動脈根部。予-80℃儲藏的主動脈組織。

4 血脂測定 根據血脂測定試劑盒說明書步驟測血清TG、TC、LDL-C和HDL-C濃度。

5 血清中MMP-9檢測 應用雙抗體夾心ELESLL試劑盒法檢測血漿MMP-9,具體操作按試劑盒操作說明進行。

6 Real-time PCR 檢測MMP-9的mRNA表達水平 Trizol法提取-80℃儲藏的主動脈組織 mRNA，紫外分光光度法測定核酸的純度與濃度。將提取的RNA逆轉錄。根據MMP-9、β-actin基因序列設計引物， MMP-9上下游引物分別為： (forward), 5-AAG GAT GGT CTA CTG GCA C-3;(reverse) 5-AGA GAT TCT CAC TGG GGC-3, 產物長度279 bp), β-actin 作為內參其上下游引物分別為： (forward), 5-TCA TGA AGT GTG ACG TTG AC-3; (reverse) 5-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GC-3, 產物長度285 bp)。擴增反應條件：95℃4min預變性；95℃20s，60℃30s，72℃1min，最后72℃延伸5min，共40個循環。每份標本做復孔。取各組PCR產物 10μl，經 2%瓊脂糖凝膠電泳80V 電壓電泳 35min，凝膠成像儀攝像,計算目標條帶灰度，并以β- actinn 的灰度作為標準對比。

7 Western blot檢測主動脈中MMP-9的蛋白表達水平 取相同部位等量主動脈組織用含PMSF 的RIPA 裂解液在冰上裂解，4℃15000rmin離心5min；取上清液以BCA法測蛋白濃度；取等量蛋白與樣本緩沖液混合煮沸5min后，進行SDS-PAGE電泳后電轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h ,TBST洗膜,分別加入兔抗鼠MMP-9一抗(1∶500)4℃孵育過夜，TBST洗滌3次 每次15min 加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶1500)置室溫顯色1h,TBST洗膜3次，進行化學發光反應，應用冷CCD照相機直接拍攝化學發光膜，Quality One 軟件(Bio-Rad)分析目標帶的累積光密度值(IOD)，并與內參β-actin 比較。

結 果

1 血清血脂含量變化 見表1。 小鼠在給予黃芩苷干預8周后與對照組相比，干預組小鼠血清中總膽固醇水平降低(P<0.05), 血清中低密度脂蛋白水平明顯降低(P<0.01)，黃芩苷高劑量組較低劑量組降低的明顯(P<0.05)；黃芩苷干預組血清中高密度脂蛋白及甘油三酯含量雖有變化但無統計學意義。

表1 各組小鼠血脂水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與對照組比較，**P<0.01;與黃芩苷低劑量組比較，#P<0.05

2 黃芩苷對血清中MMP-9水平的影響 見表2。 在給予黃芩苷干預8周后，干預組小鼠血清中MMP-9表達均明顯低于對照組(P<0. 01)，其中黃芩苷高劑量組較低劑量組的MMP- 9表達低(P<0. 05)。

表2 各組小鼠血清中MMP-9的比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與黃芩苷低劑量組比較，#P<0.05

3 黃芩苷對ApoE -/-小鼠主動脈組織中MMP-9mRNA的影響 在黃芩苷高、低劑量組小鼠主動脈組織中MMP-9mRNA的表達較對照組相比減少(P< 0. 01)，且高劑量組MMP- 9mRNA的表達低于低劑量組(P<0. 05)。

4 黃芩苷對主動脈MMP-9蛋白表達的影響 在給予不同劑量黃芩苷干預8周后，無論高劑量組還是低劑量組的小鼠主動脈MMP-9蛋白表達均明顯低于對照組(P<0. 01)，其中高劑量組 MMP- 9蛋白的表達比低劑量組低(P<0. 05)。

討 論

AS斑塊的不穩定或破裂是導致腦卒中和急性冠狀動脈綜合征的主要發病機制[1]。所以對AS 易損斑塊的干預對預防急性心腦血管事件有重要意義。動脈粥樣硬化斑塊主要是纖維帽及脂質核構成，纖維帽的厚度和脂質核心的大小是決定斑塊穩定性的重要因素。通過抑制脂質向內皮下聚集及對保持纖維帽一定厚度對維持AS斑塊穩定具有重要作用。

MMP-9作為基質金屬蛋白酶重要成員之一，主要降解細胞外型膠原和彈力纖維。在AS斑塊中，MMP-9主要由巨噬細胞等炎性細胞所分泌，它可降解細胞外膠原及彈性蛋白，從而利于炎性細胞向內皮下浸潤，加速As進程，同時導致原有斑塊的纖維帽變薄、甚至崩解，以致斑塊破裂。多項研究表明，在外周血及動脈斑塊中MMP-9的高表達與AS斑塊穩定性相關，是導致斑塊不穩定的主要因素之一[9,10]。

黃芩苷(Baicalin)是從唇形科植物黃芩( Scutel laria baicalensis georigi)的干燥根中提取的一種黃酮類化合物。現代醫學研究表明：其具有抗炎、抗氧化、抑制平滑肌細胞增殖、降脂等作用，是通過抑制炎性因子分泌、促使如超氧化物歧化酶、抗過氧化氫酶、谷胱苷肽過氧化物酶等抗氧化的相關酶表達增高等發揮作用。楊偉忠等發現在大鼠永久性大腦中動脈阻塞動物模型中，黃芩苷通過抑制MMP-9表達，改善腦神經損害，然而有關黃芩苷對在動脈粥樣硬化斑塊中MMP-9表達的影響少有報道。

我們以ApoE -/-小鼠作為研究對象，通過給予不同劑量黃芩苷干預，發現黃芩苷組較對照組小鼠主動脈及血清中MMP-9表達減低，同時血清中膽固醇及低密度脂蛋白降低，均具有統計學意義。故本研究表明黃芩苷可以降低ApoE基因敲除小鼠血清中血脂和MMP-9水平，并可降低動脈粥樣硬化斑塊中MMP-9表達。這可能是黃芩苷穩定動脈粥樣硬化斑塊、抗動脈粥樣硬化作用機制之一。

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(收稿：2014-10-30)

Effects of Baicalin on the expression of Matrix Metalloproteinases-9 at early stage of atherosclerosis in Apolipoprotein E knockout mice

University(Xi’an 710061) Liu XiaojunWan ZhaofeiWang Xinhong et al

Department of Cardiovasology，the First Affiliated Hospital Medical School of Xi’an Jiao tong

Objective： To explore the effects of Baicalin on the expression of MMP-9 at early stage of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice(ApoE -/- ). Methods： Male 8-week-old ApoE-/- mice fed with high fat diet for 8 weeks were randomly divided into three groups (n=8 each) : control group, low-dose Baicalin treated group, high-dose Baicalin treated group. All the animals were fed for 8 weeks．After administered for 8 weeks, mice were sacrificed．serum TG、TC、LDL-C and HDL-C was measured. The serum MMP-9 concentration was measured by ELISA. The expression of aortic MMP-9 mRNA and protein in each group mice were determined by Real-time PCR and Western blot respectively．Results： Compared with control group, serum TC level in Baicalin treated groups were reduced (P<0.05), serum LDL-C level in Baicalin treated groups were reduced obviously (P<0.01), especially in high-dose Baicalin (P< 0.05),but The serum TG、HDL-C level did not have significant differences between groups. The level of serum MMP-9 in the Baicalin treated groups was lower than that in the control group, significantly in high-dose Baicalin (P<0.05). Meanwhile, the expression of aortic MMP-9 mRNA and protein detected by Real-time PCR and Western blot, decreased in Baicalin treated groups compared with that in control group (P< 0.01), which in the high-dose Baicalin treated group were reduced more (P< 0.05). Conclusion：The serum level of Lipids and MMP-9 in ApoE -/- mice and the expression of MMP-9 in aortic atherosclerotic plaque are reduced by Baicalin, which it shows has regulation function on stability of the plaque．

Arteriosclerosis Triglycerides @Scutellaria baicalensis Animals,laboratory Mice

*國家自然科學基金項目(81025002)

動脈硬化 甘油三酯類 @黃芩苷 動物，實驗 小鼠

R543

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.04.001

△西安交通大學醫學院第二附屬醫院心內科

▲陜西省人民醫院心內一科

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