地諾孕素治療子宮內膜異位癥的機制分析*

張玉虹 梁登輝 孫喜斌 李立楠 焦桂清 賈麗英 劉曉娟

河北北方學院附屬第一醫院婦科(張家口075000)

地諾孕素治療子宮內膜異位癥的機制分析*

張玉虹 梁登輝 孫喜斌 李立楠 焦桂清 賈麗英 劉曉娟

河北北方學院附屬第一醫院婦科(張家口075000)

目的：研究地諾孕素治療子宮內膜異位癥(EMT)的信號通路途徑。方法：從2012年3月至2013年3月，將我院180例女性患者的子宮內膜組織作為研究對象，根據子宮內膜情況隨機分成四組，分別為：正常對照組(45例)；正常地諾孕素組(45例)；異位對照組(45例)；異位地諾孕素組(45例)。以3D膠原凝膠培養對各組細胞在TPL作用凝膠表面積實施測量，記錄并對比細胞密度的變化情況。熒光定量測定各組細胞在經地諾孕素作用之后的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等相關信號轉導通路關鍵分子基因的表達。結果：異位地諾孕素組在作用后的RhoA水平、ROCKⅠ、ROCKⅡ均分別顯著低于異位對照組的，以及正常地諾孕素組的，差異均有統計學意義(均P<0.05)。此外，正常地諾孕素組的RhoA水平、ROCKⅠ、ROCKⅡ均分別顯著低于正常對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。異位地諾孕素組在作用后的細胞表面積，均分別顯著小于異位對照組，以及正常地諾孕素組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。正常地諾孕素組的細胞表面積、細胞密度，均分別顯著小于正常對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。結論：以地諾孕素治療EMT疾病的主要作用靶點可能位于Rho/ROCK，且地諾孕素可有效抑制子宮內膜細胞的增殖及纖維化作用，臨床治療時應予以關注。

子宮內膜異位癥(EMT)主要特點是子宮內膜組織發生異位生長以及與之相關的盆腔疼痛和痛經，以及不育不孕等。近年來，該病在臨床上的發病率有上升的趨勢。據統計，大約有80%比例的EMT患者常伴隨有盆腔疼痛，而50%的患者則合并有不孕不育[1]。盡管國內外對于EMT進行了較多基礎及臨床研究，亦取得了一些進展，然而對EMT病因及發病機制仍不甚清楚，因此臨床醫務工作者們常在治療EMT時陷入困境，這亦導致EMT逐漸成為了難治之癥，有諸多棘手問題需要解決[2]。有報道稱[3]，地諾孕素作為一類新藥對EMT疾病有較好療效，然而其具體的作用機制卻仍需探索。鑒于此，本文主要對地諾孕素對于EMT的相關機制的探討，現報道如下。

資料和方法

1 一般資料 從2012年3月至2013年3月，將我院180例女性患者的子宮內膜組織作為研究對象，患者年齡均在25～49歲間，平均年齡為51.3±2.9歲。全部患者均為女性，病程為1～15周，平均病程為7.7±2.3周。其中EMT診斷標準[4]為：①患者有痛經癥狀，且呈進行性加重，部分患者有不孕和月經不調等癥狀；②經婦科檢查顯示子宮增大，附件及結節有觸痛感；③B超和腹腔鏡顯示有累及病變。

2 模型制備 子宮內膜異位囊腫基質細胞(Endometriosis stromal cells，ECSC)與神經干細胞(Neural crest stem cells，NCSC)分離和培養，以及傳代。實驗組90例取自育齡期患者的子宮內膜，且處于增殖的中晚期，并未經歷剝除術的異位性囊腫組織。而對照組90例則取自已排除EMT，并實施子宮全切除術女性患者正常的子宮內膜處組織。全部患者于手術前的一年內并未應用激素治療。自異位于卵巢的子宮內膜組織內分離出ECSC，并經酶消化后得到ECSC，種植于含100IU/ml的青霉素，50mg/ml的鏈霉素，以及10%熱滅活的FBS，DM EM6孔板內。在37℃及5% CO2條件下培養，約5～6d細胞會長滿瓶底，即可傳代。將上清液吸除，以2.5g/L的胰酶消化，在顯微鏡下觀察到細胞收縮且變圓之后，吸去消化液，并加入培養液。以吸管吹打瓶壁細胞，擴大培養。ECSCs經3代培養之后，純度已大于99%。通過含波形蛋白和CD10，及細胞角蛋白和第八因子，以及白細胞共同抗原抗體實施免疫細胞的染色。為下列實驗所用。為確保得到足夠數量細胞，可選第3代細胞實施實驗，且每1次分離后的細胞進行1次實驗。

3 研究方法 將180例實驗品分成4組，分別為①正常對照組(45例)：即正常培養NCSC組；②正常地諾孕素組(45例)：即以TPL50nM進行處理的NCSC組；③異位對照組(45例)：即正常培養ECSC組；④異位地諾孕素組(45例)，即以地諾孕素50nM進行處理的ECSC組。

4 觀察指標 以3D膠原凝膠培養對各組細胞在TPL作用凝膠表面積實施測量，記錄細胞密度的變化情況。熒光定量測定各組細胞在經地諾孕素作用之后的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等相關信號轉導通路關鍵分子基因的表達，其中RhoA(79bp)上游引物為：“CACGCTCAGCACCTTCATTG”，下游引物為：“TTGTCATAGGTCACTTCACACACAC”； ROCKⅠ(190bp)上游引物為：“GCGGGTTTGCCTACAGGTAGATT”，下游引物為：“ACTTGAAAGTGAAAGTCCCTTCCTC”； ROCKⅡ(272bp)上游引物為：“ATGTCCGACCTGTTACTC”，下游引物為：“GTGGCATCTACTGCACTCTA”；β-actin(142bp)上游引物為：“TGGCACCCAGCACAATGAA”，下游引物為：“CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA”。逆轉錄試劑盒選用美國TaKaPa公司PrimeScrit RNA產品，RT-PCR試劑盒亦選用該公司SYBR PrimeScript產品，此外兔抗人RhoA多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin多克隆抗體購自美國Invitrogen公司，PT-PCR擴增儀為美國ABI公司PRISM 7900HT Realtime型。按有關說明書步驟嚴格操作，明確地諾孕素是否通過Rho/ROCK的途徑發揮其作用。

結 果

1 各組定量檢測指標的關鍵分子基因表達水平對比 異位地諾孕素組在作用后的RhoA水平為0.27±0.02，ROCKⅠ為0.32±0.05，ROCKⅡ為0.27±0.12，均分別顯著低于異位對照組的0.66±0.03，0.75±0.13，0.69±0.08，以及正常地諾孕素組的0.32±0.11，0.35±0.02，0.31±0.02，差異均有統計學意義(均P<0.05)。表明地諾孕素可明顯降低EMT患者RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等指標的關鍵分子基因表達水平。此外，正常地諾孕素組的RhoA水平為0.32±0.11，ROCKⅠ為0.35±0.02，ROCKⅡ為0.31±0.02，均分別顯著低于正常對照組的0.43±0.02，0.46±0.12，0.36±0.04，差異均有統計學意義(均P<0.05)。表明地諾孕素亦可對正常子宮內膜干細胞分子基因的表達產生一定的降低作用，見表1。

表1 各組定量檢測指標的關鍵

注：與異位地諾孕素組比較，*P<0.05，△P<0.05

2 各組細胞表面積及細胞密度水平對比 異位地諾孕素組在作用后的細胞表面積為211.7±12.3μm2，細胞密度為11.3±2.5/HP，均分別顯著小于異位對照組的376.5±15.3μm2，17.5±3.3/HP，以及正常地諾孕素組的251.3±11.4μm2，12.7±2.4/HP，差異均有統計學意義(均P<0.05)。表明地諾孕素可促進有關變異細胞逐漸恢復。此外，正常地諾孕素組的細胞表面積為251.3±11.4μm2，細胞密度為12.7±2.4/HP，均分別顯著小于正常對照組的284.3±10.5μm2及15.4±1.2/HP，差異均有統計學意義(均P<0.05),見表2。

表2 各組細胞表面積及細胞密度水平對比

注：與異位地諾孕素組比較，*P<0.05，△P<0.05

討 論

現如今， EMT治療目前仍無治愈藥物，僅可緩解有關癥狀，臨床上主要是針對不孕及疼痛，并依照患者實際情況加以選擇相應的手術及藥物，控制患者疼痛，降低復發。朱琴等[5]報道稱，可選藥物主要集中在怎樣降低患者機體雌激素水平的活性方面，故其引發的高復發率逐漸成為了臨床上明顯的問題。隨著人們對EMT認識程度的加深，有關學者從EMT發病機制涉及的信號轉導通路等問題入手，通過分子治療EMT的方案不斷得到人們關注[6]。在EMT發生及發展過程中，纖維組織發生過度增殖及纖維化致使瘢痕形成，從而導致慢性疼痛及組織功能的變化[7]。因此，纖維組織的增殖及纖維化可視作EMT特征性病變，故闡明與其有關的纖維化發展潛在機制，找尋一類較為理想的可預防、減輕亦或是逆轉EMT的治療方案，已稱為EMT治療時急待解決的問題[8]。

Rho-Rock是普遍存于機體各組織內的一條信號轉導通路，其關鍵分子主要含Rho、Rock及肌球蛋白磷酸酶[9]。哺乳動物的細胞中，含20種以上不同Rho蛋白，但主要以對RhoA、Racl和Cdc42的研究最為廣泛。國外有報道表明[10]，Rho-Rock通路與EMT的進展有較大聯系，且與纖維組織發生的過度纖維化有關，因此本文將Rho-Rock通路作為對EMT疾病的研究對象。

地諾孕素是一類混合型孕激素，其可用作臨床治療EMT疾病，可同時發揮天然及合成性孕激素的藥理學優點。Thomas等指出，在緩解EMT疼痛上，地諾孕素療效可相當于醋酸亮丙瑞林，而其安全性及耐受性相對更佳[11]。

本文通過研究發現，異位地諾孕素組在作用后的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等指標的關鍵分子基因表達水平均下降，且異位地諾孕素組在作用后的細胞表面積及細胞密度均顯著低于其他各組。表明地諾孕素的抗纖維化效果主要由Rho/ROCK途徑實現，其具有抑制細胞的增殖及纖維化的有關分子機制，對治療EMT疾病有一定療效。與Luong等[12]報道結果一致，究其原因，筆者認為主要可能是以下幾方面：①Rho家族蛋白為細胞信號在轉導通路的信號轉換器及分子開關。其可重組肌動蛋白骨架蛋白，從而調控細胞生長和形態，及運動和粘附，以及轉移與細胞外基質的收縮。②將3D膠原凝膠立體培養體系應用于ECSC，成功構建了EMT纖維化形成的細胞模型。ECSC具有獨特生物學特性，其較NESC具有更強收縮性，并且其促纖維化能力是因Rho/ROCK信號轉導通路的激活。而這可能是Rock的選擇性抑制劑Fasudil抑制ECSC的增殖、收縮，誘發ECSC凋亡，并且抑制ECSC向肌纖維母細胞分化而形成的。Machairiotis等報道證實，Rho-Rock通路選擇性阻斷劑Y-27632可以改善腎、肺及肝纖維化的程度，這亦表明了Rho-Rock信號通路確實參與纖維化發生及發展進程。而De-Vos等亦研究證實異位子宮內膜有關間質細胞可分化為α-SMA洋相肌纖維母細胞，經地諾孕素治療后分化能力明顯下降，與本文報道基本一致。

綜上所述，以地諾孕素治療EMT疾病的主要作用靶點可能位于Rho/ROCK，且地諾孕素可有效抑制子宮內膜細胞的增殖及變異作用，臨床治療時應予以關注。

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(收稿：2014-03-29)

*河北省張家口市科學技術和地震局科研項目(1321081D)

子宮內膜異位癥/治療 @地諾孕素 信號傳導

R711.71

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.04.006