形態(tài)學技術(shù)在經(jīng)方研究中的應(yīng)用

王 謙 李姝玉 許 紅 高譽珊 張淑靜 李宇航

(北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京，100029)

形態(tài)學技術(shù)在經(jīng)方研究中的應(yīng)用

王 謙 李姝玉 許 紅 高譽珊 張淑靜 李宇航

(北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京，100029)

文章介紹了實驗研究常用的醫(yī)學形態(tài)學技術(shù)如石蠟切片、冰凍切片、電鏡超薄切片、組織化學和細胞培養(yǎng)等，因具有客觀、直觀等技術(shù)優(yōu)勢，在現(xiàn)代醫(yī)學教學和科研中占有重要地位。將形態(tài)學技術(shù)引入到經(jīng)方現(xiàn)代研究中，對于闡釋經(jīng)方組方原理、探索經(jīng)方治療常見病、疑難病的機制，亦同樣具有重要意義。

形態(tài)學；實驗技術(shù)；經(jīng)方

形態(tài)學是研究動、植物形態(tài)的科學，在生物學中占有重要地位。醫(yī)學形態(tài)學作為形態(tài)學的一個分支，是醫(yī)學教學和研究中的重要組成部分。醫(yī)學形態(tài)學的研究方法從最早的肉眼觀察，到后來各種顯微鏡技術(shù)的使用，進展到微觀領(lǐng)域，其研究結(jié)果具有客觀、直觀的特點，因而在多個研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

“經(jīng)方”一詞最早見《漢書·七略·方技略》，原指治療疾病的經(jīng)驗之方，目前中醫(yī)界則專指《傷寒論》《金匱要略》中所載的方劑。以其立法嚴謹，取效卓著，而被譽為“醫(yī)方之祖”，現(xiàn)代詮釋為“經(jīng)典方劑”。經(jīng)過多年的臨床實踐證實，經(jīng)方在治療多種疾病中均有較好的療效，因此對于經(jīng)方的研究始終長盛不衰。在研究中使用現(xiàn)代技術(shù)方法，使得經(jīng)方的研究不斷現(xiàn)代化，對經(jīng)方的現(xiàn)代研究亦具有很好的促進作用。

1 常用技術(shù)概要

在實驗研究中常用的形態(tài)學研究技術(shù)有各種切片的制作，包括石蠟切片、冰凍切片、電鏡超薄切片；細胞培養(yǎng)技術(shù)和組織化學技術(shù)等。

1.1 石蠟切片

1.1.1 技術(shù)特點 石蠟切片在常規(guī)制片技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛。石蠟切片經(jīng)過染色后可觀察細胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，這一技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于其他許多學科領(lǐng)域的研究中。石蠟切片技術(shù)還可以和免疫技術(shù)結(jié)合，如常用的免疫組織化學技術(shù)。利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，檢測組織切片中細胞組織的多肽及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的定性和定位觀察研究。

石蠟切片必須經(jīng)過染色后才能進行觀察，最常用的染色方法是HE染色方法。經(jīng)HE染色后，細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數(shù)細胞質(zhì)及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。為了顯示某些特定的結(jié)構(gòu)或成分，需要選擇專門顯示這些成分的染色方法進行染色，如膠原纖維染色(Masson)和糖原染色(PAS)等。實際工作中可根據(jù)實驗?zāi)康牡牟煌x擇合適的染色方法(圖1)。

1.1.2 應(yīng)用舉例 我們團隊在復(fù)制慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Diseases，COPD)大鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察了清熱解毒藥物配伍桔梗對模型動物病理形態(tài)學的影響。在光鏡、電鏡下分別觀察了不同配伍的中藥對大鼠病理形態(tài)的改變,并對病理切片進行半定量分析，結(jié)果顯示COPD模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)嚴重受損，炎細胞增多。而經(jīng)過清熱解毒藥物配伍桔梗治療后大鼠病理改變有改善。初步得出清熱解毒藥物配伍桔梗，在COPD的治療過程中能夠發(fā)揮增效(引經(jīng))作用，再增加甘草具有協(xié)同增效(引經(jīng))作用的結(jié)論[1]。

圖1 腦組織(HE染色，×10)

半夏瀉心湯出自《傷寒論》，我們團隊對該方進行了拆方研究。首先制備了大鼠慢性胃潰瘍模型，檢測半夏瀉心湯及其拆方對潰瘍灶肉芽組織及潰瘍灶表面黏膜厚度的影響。結(jié)果提示半夏瀉心湯及其拆方能夠促進潰瘍灶肉芽組織的良好生長，促進潰瘍灶表面黏膜的生長覆蓋，從而達到促進潰瘍愈合、降低愈合后潰瘍復(fù)發(fā)的治療作用，全方組則表現(xiàn)出最佳效果，不僅印證了張仲景組方用藥的合理性和科學性,也為進一步認識中醫(yī)“辛開、苦降、甘補法”的作用機制提供了一定的實驗依據(jù)[2]。

1.2 冰凍切片

1.2.1 技術(shù)特點 冰凍切片是將新鮮組織快速冷凍后再進行切片。制片周期較石蠟切片短，可用于組織結(jié)構(gòu)的快速觀察，也可用于一些不適于石蠟切片制備的組織的觀察，如脂肪組織。冰凍切片也可以進行各種染色(圖2)。石蠟切片和冰凍切片均可用光學顯微鏡進行觀察。

圖2 肝脂肪變性(冰凍切片，油紅O染色，×40)

1.2.2 應(yīng)用舉例 團隊對糖尿病并發(fā)癥有專門的研究。KKAy小鼠是一種自發(fā)糖尿病模型小鼠，利用小鼠觀察了中藥對糖尿病并發(fā)癥的治療作用。HE染色的石蠟切片顯示糖尿病小鼠肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞胞漿有明顯空泡，肝細胞有脂肪變性。進而利用冰凍切片進行油紅O染色，明確空泡內(nèi)確為脂肪。研究結(jié)果顯示能改善糖尿病小鼠肝臟結(jié)構(gòu)，對糖尿病造成的肝臟損害具有一定的保護作用[3]。

1.3 電鏡超薄切片

1.3.1 技術(shù)特點 光學顯微鏡可觀察細胞的結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡則能觀察亞細胞結(jié)構(gòu)。常用的有透射電鏡和掃描電鏡技術(shù)，前者用于觀察細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等；后者用于觀察樣本表面的變化，如支氣管的微絨毛(圖3)。超薄電鏡切片需要使用電子顯微鏡進行觀察。

圖3 心肌細胞(TEM，×8000)

1.3.2 應(yīng)用舉例 我們團隊研究了黃芪注射液和葛根素注射液對2型糖尿病小鼠腎臟病理改變的影響，在早期光鏡僅觀察到腎小球體積增大，腎小管上皮細胞有明顯空泡，未見其他改變。但通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)腎小球基底膜有局灶性增厚，系膜基質(zhì)、系膜細胞增多，間質(zhì)細胞增生。說明在早期已經(jīng)出現(xiàn)了輕微的硬化性改變，且中藥可以減輕這些病理損害[4]。

利用電鏡技術(shù)，我們還觀察了中藥對糖尿病模型小鼠腦微血管病變的影響，通過電鏡觀察，顯示模型組小鼠神經(jīng)細胞核染色質(zhì)疏松，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)縮小，核糖體減少，經(jīng)過中藥治療后上述改變減輕。說明中藥改善2型糖尿病動物模型KKAy小鼠腦微血管病變[5]。

1.4 組織化學技術(shù)

1.4.1 技術(shù)特點 組織化學是運用物理學、化學、免疫學、分子生物學等原理與技術(shù)，對組織與細胞的化學成分、化學反應(yīng)及其變化規(guī)律進行定性、定位和定量研究的科學，是介于這些學科之間的一門邊緣科學。其中在實際工作中較常用的是免疫組織化學技術(shù)(圖4)。

圖4 心臟(免疫組化，×20)

1.4.2 應(yīng)用舉例 團隊在復(fù)制大鼠慢性胃潰瘍模型的基礎(chǔ)上，通過免疫組化的方法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)，對半夏瀉心湯進行拆方研究。結(jié)果表明，半夏瀉心湯及其拆方各組均有不同程度的調(diào)節(jié)胃黏膜細胞增殖作用。拆方各組中，部分藥組之間呈協(xié)同的作用趨勢，部分藥組之間呈制約趨勢。綜合評價其總體療效，以全方組最佳，從而印證了仲景組方的合理性和科學性[6]。

圖5 體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞×10

圖6 慢病毒載體感染小鼠NIH3T3細胞×20

1.5 細胞培養(yǎng)技術(shù)

1.5.1 技術(shù)特點 從組織中獲取細胞并使其在體外生長稱為原代培養(yǎng)。也可購買細胞株直接進行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞是進行各種醫(yī)學實驗的良好材料。由于細胞種類單一，可用于觀察特定細胞對刺激因素的反應(yīng)，也可進行較深入的機制研究。但由于是體外培養(yǎng)，細胞的反應(yīng)與體內(nèi)存在一定的差異(圖5,圖6)。

1.5.2 應(yīng)用舉例 我們團隊體外培養(yǎng)了人腎小管上皮細胞，并在此基礎(chǔ)上研究中藥對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，中藥可以阻斷或逆轉(zhuǎn)上皮細胞的轉(zhuǎn)分化[7]。我們還研究了中藥對人近曲小管上皮細胞細胞增殖的影響，以及對高糖誘導(dǎo)后細胞內(nèi)GRP78表達的影響。結(jié)果顯示，葛根素可促進細胞增殖，并且可通過增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78的表達量，以促進蛋白質(zhì)正確折疊，來恢復(fù)細胞的穩(wěn)態(tài)，從而減輕糖尿病時腎臟的結(jié)構(gòu)損傷[8]。

2 應(yīng)用體會

以上這些基本的形態(tài)學技術(shù)可以與經(jīng)方的研究緊密結(jié)合起來，為經(jīng)方的實驗研究提供可靠的技術(shù)保障。在以下幾方面，形態(tài)學技術(shù)都可以為經(jīng)方的研究提供技術(shù)保障。

2.1 形態(tài)學技術(shù)可以客觀判定疾病模型的成功與否 由于經(jīng)方是在臨床實踐中形成的經(jīng)典方劑，治療的對象是各種疾病。因此，復(fù)制多種疾病的動物模型，并在此基礎(chǔ)上研究經(jīng)方的治療效果是經(jīng)方研究中的基礎(chǔ)工作。動物的疾病模型復(fù)制是否具備與人類疾病相似的改變，直接決定了后續(xù)的研究是否能繼續(xù)，而很多動物的疾病模型病變的判斷需要依賴形態(tài)學技術(shù)，在一些疾病中，形態(tài)學改變對于疾病的診斷起關(guān)鍵作用。如真武湯、五苓散、豬苓湯等均可用于治療糖尿病腎病，若在經(jīng)方的研究中結(jié)合形態(tài)學技術(shù)則能更客觀，研究結(jié)果也更容易被接受[9]。糖尿病腎病的主要形態(tài)學表現(xiàn)為早期腎小球肥大，晚期為腎間質(zhì)和腎小球纖維化。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病腎病KKAy小鼠具有典型的糖尿病腎病的形態(tài)改變，黃芪可減輕該小鼠的腎臟病理損害，明確其對糖尿病腎病有治療作用[3，10]。

2.2 形態(tài)學技術(shù)可用于經(jīng)方治療疾病的機理研究 在實驗研究中，除了觀察經(jīng)方對多種疾病的治療效果，更重要的是揭示其作用機制和作用環(huán)節(jié)，進而指導(dǎo)今后的中醫(yī)臨床。我們團隊研究了TGF-β1信號通路在糖尿病腎病發(fā)病中的作用及其中藥的作用位點。由于在一個器官中有多種組織，僅通過分子生物學手段研究某些因子的表達情況，只能說明在器官中的平均表達水平，無法確定其在某一特定細胞或組織中的表達。如能將形態(tài)學技術(shù)與分子生物學技術(shù)結(jié)合起來，既能確定某一種因子的表達高低，又能將這種表達的改變定位，對于治療的作用機理的研究具有重要意義。我們曾將免疫組織化學技術(shù)與臨床生化指標檢測、分子生物學技術(shù)結(jié)合起來，不但能說明中藥的治療效果，還能進行機制研究[11]。

除了進行在體實驗，還可以在體外培養(yǎng)細胞，利用細胞培養(yǎng)技術(shù)進行較深入的機制研究。我們團隊發(fā)現(xiàn)中藥對糖尿病腎病小鼠早期腎臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有一定的影響，為了確定中藥是否對腎小管上皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有同樣的作用，就利用體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞—HK-2細胞，經(jīng)過高糖刺激后，觀察中藥對該細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。發(fā)現(xiàn)高糖確實能誘導(dǎo)HK-2細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，中藥對過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有一定的抑制作用[8]。

2.3 形態(tài)學技術(shù)可用于經(jīng)方的配伍研究 通過拆方研究，確定最佳的配伍比例，可以為臨床醫(yī)生提供可靠的實驗依據(jù)。有實驗通過復(fù)制臨床關(guān)節(jié)炎疾病的大鼠模型，比較了大鼠造模前后不同配伍比例的芍藥甘草湯的治療效果，發(fā)現(xiàn)芍藥甘草1∶1配伍時的止痛作用起效明顯早于其他配伍比例，證實了芍藥甘草湯原方配伍應(yīng)用的科學性和合理性。同時應(yīng)用了免疫組織化學的方法發(fā)現(xiàn)TRPV1(瞬時受體電位通道香草醛亞型-1，transient receptor potential vanilloid type-1)通道蛋白的表達可能是芍藥甘草湯臨床上發(fā)揮止痛作用的分子機制之一，同時也表明干預(yù)該靶點可能是芍藥甘草湯中芍藥和甘草1∶1配伍止痛效應(yīng)最大化的分子基礎(chǔ)[12]。

為研究半夏瀉心湯的配伍規(guī)律，將該方拆成辛開藥(半夏、干姜,X)組，苦降藥(黃芩、黃連，K)組，甘補組(人參、炙甘草、大棗，G)組，并進行交叉組合成XK、XG、KG組，及全方組(Q)。復(fù)制大鼠慢性胃潰瘍模型后，分別給予上述各組藥物治療，比較各組大鼠血清胃泌素的水平。結(jié)果表明X、K、G、KG組藥物對胃泌素無明顯影響；XK、XG組藥物對胃泌素有明顯影響，其中XG組的作用與Q組相近。上述結(jié)果提示：不同辛味藥物之間的配伍，直接影響其生物效應(yīng)[13]。這一實驗結(jié)果為性味配伍理論提供了實驗支持依據(jù)。

2.4 形態(tài)學技術(shù)可用于經(jīng)方及中醫(yī)基本理論的研究 我們團隊在復(fù)制大鼠COPD模型的基礎(chǔ)上，觀察了宣肺中藥對其的影響，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用宣肺中藥從肺論治COPD，肺組織病理改變減輕的同時伴見腸組織病理改變呈改善趨勢，從側(cè)面印證了中醫(yī)“肺合大腸”臟腑相關(guān)理論，肺-腸之間存在著一定的相關(guān)性及互動調(diào)節(jié)現(xiàn)象。該項研究即使用了形態(tài)學技術(shù)，首先證實了模型大鼠具備了COPD的基本病理變化和宣肺中藥對此病理改變有減輕作用，進而利用分子生物學技術(shù)證實宣肺中藥提高了腸組織IFN-γ、降低了IL-10mRNA的表達，一定程度上證實了肺-腸之間存在著一定的特異性互動效應(yīng)機制，為探討“肺合大腸”中醫(yī)臟腑相關(guān)理論奠定基礎(chǔ)[14]。

以上僅列舉了一些在經(jīng)方研究中用到的形態(tài)學技術(shù)，在今后的工作中，可以在更多領(lǐng)域使用形態(tài)學技術(shù)，形態(tài)學技術(shù)本身也隨著科技的發(fā)展不斷豐富。古老經(jīng)方的研究與不斷發(fā)展的形態(tài)學技術(shù)相結(jié)合，可以從不同角度和側(cè)面闡釋經(jīng)方的組方理念，總結(jié)其治療原則，讓更多的學者掌握經(jīng)方的科學內(nèi)涵，以更方便臨床醫(yī)生在實踐使用經(jīng)方。

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(2014-12-05收稿 責任編輯：洪志強)

Applying Morphological Techniques in the Research of Classical Formula

Wang Qian，Li Shuyu，Xu Hong，Gao Yushan，Zhang Shujing，Li Yuhang

(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

To introduce some morphological techniques commonly used in medical teaching and research, i.e. paraffin section, frozen section, electron microscopyultrathin section, histochemistry and cell culture. Due to the objectiveness and visualization of these techniques, they would play a significant role in the research of classical formula, helping to explain the principles underlying formula composition, to explore the mechanism of action, esp. for some common or obstinate diseases.

Morphology; Laboratory techniques; Classical formula

北京中醫(yī)藥大學“經(jīng)方現(xiàn)代應(yīng)用關(guān)鍵科學問題的基礎(chǔ)研究”創(chuàng)新團隊(編號：2011-CXTD-04)

王謙，女，教授，Tel：(010)64286965，E-mail：wangqianchai@163.com

李宇航，男，教授，博士生導(dǎo)師，地址：北京市北三環(huán)東路11號北京中醫(yī)藥大學，郵編：100029，電話：(010)64287503，E-mail：liyuhang@bucm.edu.cn

R289

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.005