養心通脈有效部位方對BMSCs移植心血瘀阻證心肌的實驗研究

陳 夏 鄭景輝， 李勇華 袁肇凱 孫貴香 簡維雄 黃獻平

(1 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧，530011； 2 湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，長沙，410007； 3 重慶三峽醫藥高等專科學校，萬州，404020)

養心通脈有效部位方對BMSCs移植心血瘀阻證心肌的實驗研究

陳 夏1鄭景輝1，2李勇華3袁肇凱2孫貴香2簡維雄2黃獻平2

(1 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧，530011； 2 湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，長沙，410007； 3 重慶三峽醫藥高等專科學校，萬州，404020)

目的：觀察養心通脈部位方(Active Principle Region of Yangxing Tongmai Formula，apr-YTF)對大鼠骨髓間充質干細胞(Bone Mesemchymal Stem Cells，BMSCs)移植心血瘀阻證心肌后分化為心肌樣細胞的作用。方法：采用“冠脈結扎法”結合血流變學改變建立大鼠心血瘀阻證模型。然后將大鼠分為(apr-YTF)+BMSCs組、集落刺激因子(rhG-CSF)+BMSCs組、NS+BMSCs組、NS+DMEM組。原代培養大鼠BMSCs，體外溴氮胞苷(5-bromouracil Deoxyriboside Brdu)標記后注射至大鼠心肌，采用雙染法觀察心肌組織中心肌結蛋白Desmin-Brdu和肌球蛋白重鏈(Myosin Heavy Chain MHC)-Brdu的表達。結果：apr-YTF干預BMSCs移植心血瘀阻證心肌28 d后經心肌結蛋白Desmin-Brdu抗體染色后，NS+DMEM組梗死邊緣未見雙染表達，在NS+BMSCs組、(rhG-CSF)+BMSCs和(apr-YTF)+BMSCs組均可有猩紅色Brdu抗體和棕色Desmin蛋白的同時表達，其中(rhG-CSF)+BMSCs和(apr-YTF)+BMSCs組陽性細胞計數高于NS+BMSCs組(P<0.05)；(rhG-CSF)+BMSCs組和(apr-YTF)+BMSCs組兩者之間差異無統計學意義(P>0.05)。結論：apr-YTF能促使移植于心血瘀阻證心肌環境后BMSCs向心肌細胞的方向分化。

養心通脈有效部位方；骨髓間充質干細胞；心肌梗死/中醫藥療法；細胞移植

BMSCs具有多向分化潛能，具有明顯的環境依賴性，在不同的誘導條件BMSCs可被誘導分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、神經細胞、心肌細胞[1-3]等多種組織細胞。BMSCs移植缺血心肌后可促進心肌再生、改善心臟功能[4-5]。在本課題組前期研究中也得到證實養心通脈部位方(Active Principle Region of Yangxing Tongmai Formula，apr-YTF)能促進骨髓干細胞動員入血，并定向歸巢于梗死心肌，其作用與重組人粒細胞集落刺激因子大體相當，在歸巢CD34+細胞方面甚至強于重組人粒細胞集落刺激因子，是一種良好的骨髓間充質干細胞動員劑[6]。當前對于BMSCs向心肌樣分化的研究重點主要集中在對其所處微環境的改善方面。本實驗在前期研究基礎上，復制心梗心血瘀阻證模型，進行同種異體BMSCs移植。使用傳統的活血化瘀名方apr-YTF進行干預，進一步了解了解中醫藥在BMSCs移植后存活分化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 取BMSCs選用6～8周齡清潔級雄性SD大鼠，體質量(130±20)g，造模大鼠(240±20) g，購自湖南中醫藥大學動物實驗中心。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。動物許可證號：SCXK(湘)2009-0004。

1.2 主要試劑 培養基L-DMEM，美國GIBCO公司；特級胎牛血清，北京Hyclone公司；5-氮胞苷，美國Sigma公司；養心通脈有效部位方，由中南大學藥學院依本課題組穩定的制作工藝制作提供[7]，用時用蒸餾水稀釋。FITC標記CD11b、CD45、CD90抗體，美國SERANTEC公司；小鼠抗大鼠Desmin和MHC抗體，武漢博士德公司；Trizol，美國Invitrogen公司。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)，齊魯制藥有限公司(國藥準字S19990049，批號：20121202)。

1.3 大鼠BMSCs的分離、培養和鑒定

1.3.1 BMSCs的分離與培養 雄性SD大鼠頸椎脫臼法處死，在75%乙醇中浸泡10 min。在無菌條件下快速取脛骨和股骨，去除周圍組織，切除脛骨和股骨兩端，用DMEM液反復沖洗骨髓腔，將沖洗液收集于離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入含10%胎牛血清DMEM培養基，反復吹打，細胞計數后以109/mL密度接種于50 cm2培養瓶中，37 ℃、飽和濕度、含體積分數為0.05的CO2孵育箱中培養。48 h后棄懸浮液，首次換液。以后每2 d換液1次，懸浮生長的造血細胞隨換液被棄去，留下貼壁生長的骨髓間充質干細胞。約待細胞在瓶底融合基本達到80%左右，胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 BMSCs的傳代及純化 待原代培養的細胞增殖在瓶底融合基本達到80%左右時，用0.25%胰酶消化細胞后，加培養液中止消化并反復吹打貼壁細胞，制成單細胞懸液，按1∶2傳代培養，并標記為P2，以后每天觀察細胞的生長情況，直至貼壁細胞彼此融合達到80%左右時，重復上述操作，反復傳至第4代。

1.3.3 BMSCs的鑒定 取第3代MSCs，0.25%胰酶消化后配制成細胞懸液，1%BSA封閉液10 min，PBS洗滌3次，加入FITC熒光標記的抗CD11b、CD45、CD90抗體，對照組加PBS，4 ℃孵育30 min，1 500 r/min離心5 min，PBS沖洗3次，1%以多聚甲醛固定，采用FACScan流式細胞儀檢查細胞表面抗原。

1.4 大鼠BMSCs標記及細胞懸液配制 用PBS緩沖液配制溴氮胞苷(Brdu)，終末濃度調至10 μmol/L，加入第3代大鼠BMSCs細胞培養瓶中，共同孵育72 h，倒掉培養基，用0.01 mol/L的PBS緩沖液漂洗細胞6次，以去除未結合的Brdu；再用胰蛋白酶消化后離心收集細胞，計數，加入無血清的DMEM培養基，配制成3×106/100 μL濃度的細胞懸液，4 ℃保存備用。

1.5 大鼠心血瘀阻證模型制備 取健康清潔級雄性SD大鼠，適應性飼養觀察1周。大鼠腹腔麻醉，仰臥位固定，呼吸機呼吸，行心電監測，左胸縱切口分層開胸，在肺動脈圓錐和左心耳之間，距左冠狀動脈起始2 mm處5-0號無創傷絲線，結扎左冠脈前降支，使左室前壁失去原有光澤而變蒼白，出現搏動減弱，心電監測見肢體導聯R波振幅明顯升高，隨后出現I導聯和aVL導聯J點明顯抬高，證實大鼠AMI造模成功。亦作為心血瘀阻證定位在“心”的客觀指標。

1.6 大鼠血液流變學檢測 造模后24 h，動物眶后動脈取血2 mL測定全血黏度值、血漿黏度值、全血高切、低切相對黏度等血液流變學指標。同時取10只空白大鼠檢測液流變學指標，以空白組數值95%參考值范圍作為正常值。造模組與空白組對比，血液流變學血漿黏度和全血黏度中的一項高于正常值，即出現“黏、聚、凝、稠”特征，作為心血瘀阻證定性為“血瘀”的客觀指標。

1.7 實驗動物分組

1.7.1 (apr-YTF)+BMSCs組 為實驗觀察組。于梗死區邊緣心肌組織的3個位點直接注入共約100 μL的apr-YTF注射液[生理鹽水稀釋，含生藥約20 μg，1.2 g/(kg·d)劑量]和共100 μL的BMSCs細胞懸液(含細胞數3×106)。

1.7.2 (rhG-CSF)+BMSCs組 為陽性對照組。于梗死區邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100 μL的rhG-CSF注射液和共100 μL的BMSCs細胞懸液(含細胞數3×106)。

1.7.3 生理鹽水+BMSCs組 為空白對照組。于梗死區邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100 μL的生理鹽水和共100 μL的BMSCs細胞懸液(含細胞數3×106)。

1.7.4 生理鹽水+DMEM組 為模型對照組。于梗死區邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100 μL的生理鹽水和共100 μL的DMEM緩沖液。

1.8 心肌Desmin-Brdu、MHC-Brdu蛋白免疫組織化學雙染 標本選擇10%福爾馬林固定24 h；修復一抗，非免疫的羊血清工作液(含10%驢血清)封閉，常溫下10 min；加一抗，4 ℃過夜；加兔抗鼠生物素化二抗37 ℃ 15 min，鏈酶卵白素-堿磷酶軛合物37 ℃ 15 min，堿磷酶的底物-色素混合液37 ℃ 15 min，第二次一抗孵育4 ℃過夜，相應的生物素化二抗37 ℃ 15 min，過氧化物酶標記鏈酶卵白素37 ℃ 15 min，過氧化物酶的底物-色素混合液，常溫10 min，中性樹膠封片。采用顯微鏡拍照后下手工計數的方法進行，取個標本相同部位梗死區切片，200倍拍照，然后計數整個切片中細胞核猩紅色(Brdu標記與細胞和結合)和胞漿棕色(Desmin或MHC)同時著色的細胞為雙染陽性細胞個數。

2 結果

2.1 apr-YTF對BMSCs移植后Desmin-Brdu表達的影響 apr-YTF干預BMSCs移植心血瘀阻證心肌28 d后經心肌結蛋白Desmin-Brdu抗體染色后，NS+DMEM組梗死邊緣未見雙染表達，在NS+BMSCs組、(rhG-CSF)+BMSCs和(apr-YTF)+BMSCs組均可有猩紅色Brdu抗體和棕色Desmin蛋白的同時表達(見圖1)，其中(rhG-CSF)+BMSCs和(apr-YTF)+BMSCs組陽性細胞計數高于NS+BMSCs組(P<0.05)；(rhG-CSF)+BMSCs組和(apr-YTF)+BMSCs組兩者之間差異無統計學意義(P>0.05)。(見表1)

2.2 apr-YTF對BMSCs移植后MHC-Brdu表達的影響 apr-YTF干預BMSCs移植心血瘀阻證心肌28 d后經心肌重鏈蛋白MHC-Brdu抗體染色后，NS+DMEM組梗死邊緣未見有雙染表達；在NS+BMSCs組、(rhG-CSF)+BMSCs和(apr-YTF)+BMSCs組均可見到猩紅色Brdu抗體著色和棕色MHC蛋白的同時表達(見圖2)，其中(rhG-CSF)+BMSCs組和(apr-YTF)+BMSCs組陽性細胞計數高于NS+BMSCs組(P<0.05)；前兩者之間差異無統計學意義(P>0.05)。(見表1)

表1 apr-YTF對BMSCs移植后Desmin-Brdu、 MHC-Brdu雙染陽性細胞計數(例數

注：與NS+BMSCs組比較，*P<0.05。

A:NS+DMEM組；B：NS+BMSCs組；C：(rhG-CSF)+BMSCs組；D：(apr-YTF)+BMSCs組

圖1 apr-YTF干預BMSCs移植心肌后Desmin-Brdu雙染圖片(×100)

A：NS+DMEM組；B：NS+BMSCs組；C：(rhG-CSF)+BMSCs組；D：(apr-YTF)+BMSCs組

圖2 apr-YTF干預BMSCs移植心肌后MHC-Brdu雙染圖片(×100)

3 討論

養心通脈方是我國著名中醫學家秦伯未先生運用“扶養心氣，和通血脈”之法治療胸痹心痛的有效名方[8]。是用人參、桂枝補益心氣，溫通血脈；生地黃滋陰生津，和通氣血；丹參活血養血、宣通經脈，佐以澤瀉利水滲濕，化其痰濁而補陰。諸藥合用，達到和通血脈、調養心氣之效。國內多年研究表明，該方對于缺血性心臟病、高脂血癥、動脈粥樣硬化等均具有顯著的臨床療效[9-10]。可改善冠狀循環，增加冠狀微循環血流量；增強心血管內皮細胞的抗血栓性，抑制凝血活性；調節脂質代謝；具有對抗心肌缺血再灌注損傷，防止氧自由基的毒害和增加機體的胰島素敏感性等作用[11-13]。

本課題組在臨床和實驗研究的基礎上，由養心通脈方中提取出人參皂苷、丹參酮Ⅱa、總生物堿、人參多糖、復方多糖、總揮發油等有效部位，通過對各有效成分部位的有效劑量配伍抗心肌缺血的實驗研究，研制成apr-YTF。有效部位組方可減少服用劑量，提高療效，更好更直接地發揮中醫方藥中有效物質的藥理活性作用。莫莉等[14]研究顯示apr-YTF與養心通脈方原方、麝香保心丸及重組牛堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)同樣具有促血管新生的作用，且apr-YTF作用與bFGF作用相當，明顯優于養心通脈方原方組、麝香保心丸。袁肇凱等[15]研究顯示apr-YTF功擅益氣活血，可通過刺激血管內皮細胞“增殖”“遷移”和“管腔結構形成”等不同環節，促進缺血心肌的血管生成。

心肌的修復再生與中醫“生脈、生新”理論密切相關，中醫的“氣血互根，脈為血之府”等理論為益氣活血方藥的“生脈、生新”作用提供了理論依據。冼紹祥等[16]研究中證實黃芪甲苷體外誘導BMSCs分化為心肌樣細胞。宋清等[17]用藥物預適應方法觀察中藥參三七皂苷Rg1對5-aza誘導大鼠BMSCs向心肌細胞轉化中的作用證實參三七皂苷Rg1預適應在體外可顯著刺激5-aza誘導的鼠BMSCs向心肌細胞轉化和增殖。

我們研究結果發現，apr-YTF干預BMSCs移植心血瘀阻證心肌28 d后經心肌結蛋白Desmin-Brdu抗體染色后，NS+DMEM組梗死邊緣未見雙染表達，在NS+BMSCs組、(rhG-CSF)+BMSCs和(apr-YTF)+BMSCs組均可有猩紅色Brdu抗體和棕色Desmin蛋白的同時表達，其中(rhG-CSF)+BMSCs組陽性細胞計數與高于NS+BMSCs組；(rhG-CSF)+BMSCs組和(apr-YTF)+BMSCs組兩者之間無差異。MHC-Brdu抗體染色后，NS+DMEM組梗死邊緣未見有雙染表達；在NS+BMSCs組、(rhG-CSF)+BMSCs和(apr-YTF)+BMSCs組均可見到猩紅色Brdu抗體著色和棕色MHC蛋白的同時表達，其中(rhG-CSF)+BMSCs組和(apr-YTF)+BMSCs組陽性細胞計數與高于NS+BMSCs組，前兩者之間無差異。急性心肌心血瘀阻證大鼠移植BMSCs后28 d表達心肌特異性蛋白Desmin和肌球蛋白MHC，(apr-YTF)+BMSCs明顯高于空白組和陰性對照組，與陽性對照的(rhG-CSF)無明顯差異。說明apr-YTF能夠在局部用藥的情況下加強微環境下的BMSCs向宿主細胞轉化，是益氣活血法治療心血瘀阻證的微觀機制之一。有望為臨床協助BMSCs移植增加療效提供一種安全、有效的治療手段。本實驗為益氣活血法治療缺血性心臟病提供新的理論和實驗依據。

盡管本研究初步探索改良移植微環境從而增強移植骨髓BMSCs在體存活、分化和效應，并取得初步成效，但是未能全面探討這種改良的機制。未能在更長時間內考察藥物改良移植微環境對移植BMSCs的動態影響。另外，本研究也未考察藥物改良基礎上移植BMSCs是否會產生一些新的不良反應，這些均有待今后進一步深入研究。再就是使用apr-YTF對心血瘀阻證微環境干預后，可顯著改善梗死心肌局部微環境，有利于移植細胞的存活和分化，但是具體的干預方式(全身用藥/局部用藥)干預的時間、藥物長期的不良反應及細胞是否有惡性化傾向或返祖現象，都需要作進一步研究。

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(2014-04-02收稿 責任編輯：曹柏)

Experimental Study on Effect of Active Principle Region of Yangxing Tongmai Formula on BMSCs Transplantation in Myocardium with Blood Stasis Syndrome

Chen Xia1,Zheng Jinghui1,2,Li Yonghua3,Yuan Zhaokai2,Sun Guixiang2,Jian Weixiong2,Huang Xianping2

(1RuikangHospitalofGuangxiTraditionalChineseMedicineUniversity,Nanning530011,China; 2DiagnosisResearchInstituteofHunanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Changsha410007,China; 3ChongqingThreeGorgesMedicalCollege,Wanzhou404020,China)

Objective:To observe the effect of active principle region of site Yangxing Tongmai Formula(apr-YTF) improving the rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplanted in myocardium with blood stasis syndrome differentiated into myocardial like cells.Methods:Coronary ligation combining blood rheology changes was used to set up rat blood stasis syndrome models.Then the rats were divided into (apr-YTF) + BMSCs group,recombinant human granulocyte colony-stimulating factor + BMSCs group,NS + BMSCs group,and NS + DMEM group.Primary cultured rat BMSCs,in vitro labeled by 5-romouracil deoxyriboside Brdu was injected into rat myocardium,using double staining myocardial tissue myocardial desmin Desmin-Brdu and myosin heavy chain (myosin heavy chain MHC)-Brdu expression.Results:After 28 days Desmin-Brdu myocardial desmin antibody staining,NS + DMEM group infarct border no double staining expressed in NS + BMSCs group,(rhG-CSF) + BMSCs and (apr-YTF) + BMSCs group can had scarlet and brown Desmin antibody Brdu simultaneous expression of proteins,including (rhG-CSF) + BMSCs and (apr-YTF) + BMSCs group-positive cell counts higher than NS + BMSCs group (P<0.05); (rhG-CSF) + BMSCs group and (apr-YTF) + BMSCs had no difference (P>0.05).Conclusion:Apr-YTF can promote BMSCs transplanted myocardial environmental blood stasis syndrome differentiation to cardiomyocytes .

Active principle region of Yangxing Tongmai Formul; Apr-YTF; Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells; Myocardial Infarction / TCM Therapy; Cell Transplantation

國家自然科學基金項目(編號：81102595)；廣西自然科學基金(編號：2012GXNSFAA053113，2013GXNSFAA019126)；廣西科學研究與技術開發計劃項目(編號：桂科合1347004-26)；廣西壯族自治區中醫藥民族醫藥自籌經費科研課題(編號：GZZC1223)

陳夏(1976—)，女，主治醫師，研究方向：中西醫結合心腦血管給疾病的臨床與基礎研究

鄭景輝(1976—)，男，漢族，醫學博士，副教授，主要研究方向：心腦血管疾病的中西醫結合診療，E-mail：jinghuizheng@yeah.net

R332；R256.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.020