半枝蓮提取物對黃曲霉素B1所誘發肝癌Notch1的影響

蔡林雪 劉澍楠

(1 福建醫科大學藥學院藥物分析系,福州,350004; 2 福州總院四七六醫院,福州,350001)

半枝蓮提取物對黃曲霉素B1所誘發肝癌Notch1的影響

蔡林雪1劉澍楠2

(1 福建醫科大學藥學院藥物分析系,福州,350004; 2 福州總院四七六醫院,福州,350001)

目的:探討半枝蓮提取物(ESB)對黃曲霉素B1所誘發的肝癌大鼠Notch1的影響。方法:選取60只Wistar大鼠,隨機分為空白組、模型組、半枝蓮提取物低、高劑量組,每組15只。建立用黃曲霉素B1所誘發的肝癌大鼠的動物模型。其中空白組與模型組給予蒸餾水灌胃,半枝蓮提取物低、高劑量組給予不同濃度的ESB灌胃治療。灌胃1次/d,連續治療1個月。治療結束后將所有大鼠處死,觀察各組大鼠的體質量、肝表面的結節數,并取肝組織采用免疫組化法檢測肝組織中Notch1的表達情況。結果:與空白組比較,模型組和ESB低、高劑量組大鼠的體質量明顯降低(P<0.05),肝表面的結節數明顯增多(P<0.05),Notch1陽性細胞數明顯升高(P<0.05);與模型組比較,ESB低、高劑量組大鼠的體重升高(P<0.05),肝表面的結節數及Notch1陽性細胞數明顯降低(P<0.05)。結論:低、高劑量的半枝蓮提取物能夠有效的抑制肝癌的惡化,其機制可能與下調肝組織中Notch1有關。

半枝蓮提取物;黃曲霉素B1;肝癌;Notch1

半枝蓮(ScutellariaBarbataD.Don),學名為大花馬齒莧,屬于黃芩亞科植物,其性寒、苦、辛具有活血祛瘀、清熱解毒、消腫止痛等作用。中醫常用于治療咽喉腫痛、疔瘡、毒蛇咬傷、水腫、黃疸等,現代臨床常廣泛用于癌癥的治療中,但有關半枝蓮抗腫瘤的機制尚不明確[1-2]。肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其每年的新發率和死亡率均占全球的50%以上,我國肝癌的死亡率占所有癌癥死亡率的14%,僅次與肺癌,其中農村發病率明顯高于城市,受到廣泛的重視[3]。本實驗通過觀察半枝蓮提取物對黃曲霉素B1所誘發肝癌大鼠肝臟中Notch1的影響,探討半枝蓮抗癌的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 半枝蓮,廣州市藥材公司;黃曲霉素B1(AFB1),啟東肝癌研究所提供;免疫組化SP試劑盒,Bio-Rad公司;Notch1抗體,美國Cell Signaling公司;凝膠成像系統,Bio-Rad公司

1.2 半枝蓮提取物(ESB)的制備 取新鮮半枝蓮進行清洗、烘干、粉碎、經過3次2 h水提后,合并水提后的濾液,進行濃縮噴霧干燥,其規格為10:1。

1.3 動物與分組 選用Wistar大鼠60只,4周齡,雌雄各半,(150±5.2)g,由上海實驗動物中心提供,實驗前適應性飼養1周。采用隨機分組法將60只大鼠隨機分為空白組、模型組、半枝蓮提取物低劑量組(ESB低組)、半枝蓮提取物高劑量組(ESB高組),每組15只。

1.4 肝癌大鼠模型的制備 參照陳志英等[4]建立短期的黃曲霉素B1所誘發肝癌大鼠模型。采用二甲基砜(DMSO)溶解黃曲霉素B1后,按400 μg/kg溶解液腹腔注射2周,每周6次。注射結束后,改用含0.015%的2-AFF飼料喂養大鼠2周。

1.5 實驗干預 ESB低組給予ESB 6 g/kg灌胃治療、ESB高組ESB 12 g/kg灌胃治療,1次/d,連續治療30 d。模型組與正常組給予蒸餾水0.5 mL灌胃,其療程同枝蓮提取物灌胃組。

1.6 免疫組化法檢測肝癌組織中Notch1的表達 治療結束后,將75只大鼠處死后,冰上操作,取肝組織放于4%多聚甲醛固定液中固定24～48 h,常規石蠟包埋。將包埋好的組織進行石蠟切片后為5 μm黏附在載玻片上,放入二甲苯I 15 min,二甲苯II 15 min,100%乙醇I 3 min,100%乙醇II 3 min,95%乙醇3min,80%乙醇3 min,70%乙醇3 min,雙蒸水沖洗1 min,PBS洗3次×3 min進行脫蠟和水化處理。用3%H2O2室溫下孵育15 min,以消除內源性過氧化物酶活性。PBS沖洗3次,置于0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液微波爐內抗原修復30 min,加入10%正常山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min。加入一抗稀釋液稀釋后的兔抗大鼠的Notch1抗體,4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次×5 min,加入生物素標記的羊抗鼠IgG(二抗),室溫靜置30 min。PBS洗3次×5 min,滴加三抗(辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素),37 ℃溫箱孵育30 min。DAB顯色5～10 min,鏡下掌握染色程度,自來水沖洗10 min。蘇木素復染,常規脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察結果。

2 實驗結果

2.1 各組大鼠的體質量的比較 模型組與ESB低組、ESB高組大鼠的體質量明顯低于空白組,差異有統計學意義(P<0.05);ESB低組、ESB高組大鼠的體質量明顯高于模型組大鼠的體質量,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

2.2 各組大鼠肝表面的結節數的比較 模型組與ESB低組、ESB高組大鼠的肝表面的結節數明顯高于空白組大鼠,差異有統計學意義(P<0.05);ESB低組、ESB高組大鼠肝表面的結節數明顯低于模型組大鼠,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

2.3 各組大鼠肝組織中Notch1蛋白表達情況 Notch1蛋白陽性表達為棕褐色顆粒,位于細胞膜或是胞質內。模型組與ESB低組、ESB高組大鼠的Notch1陽性表達細胞數明顯高于空白組大鼠,差異有統計學意義(P<0.05);ESB低組、ESB高組大鼠Notch1陽性表達細胞數明顯低于模型組大鼠,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1、表1。

表1 各組大鼠的體質量、肝表面的結節數、 Notch1蛋白的比較

注:與空白組比較,*P<0.05,與模型組比較，▲P<0.05。

注:A.空白組;B.模型組;C.ESB低組;D.ESB高組。

圖1 各組大鼠肝組織中Notch1蛋白表達的比較(×400)

3 討論

黃曲霉素為二氫呋喃香豆素的衍生物,主要為黃曲霉寄生曲霉產生的次生代謝產物,目前已經發現20多種,其中以黃曲霉素B1最為常見,且毒性最強。其毒性可以導致肝肝細胞脂肪變性及出血性壞死等,黃曲霉素B1其致癌力極強是目前已經的最強致癌物之一[5]。

半枝蓮是一種類似薄荷的唇型科植物,其提取物可以破壞為癌組織供應血液的血管,是一種常用的抗癌藥物,其抗癌效果較好,且對正常細胞無損壞。研究表明半枝蓮提取物能夠H22肝癌荷瘤有明顯的抑制作用,且能夠減輕毒性反應,延長生存時間,改善荷瘤小鼠的免疫功能[2,6]。ESB能夠抑制肝癌細胞的增殖,阻滯細胞周期,促進細胞凋亡。

Notch1是Notch信號家族中的一個受體,其參與腫瘤的發生、增殖、分化和轉移的過程。Notch信號通路,廣泛存在于各種動物中,能夠動態的影響細胞發育的多個過程,其信號的紊亂與腫瘤的發生發展密切相關。正常肝組織中均能檢測出Notch信號通路的四個受體Notch1、Notch2、Notch3、Notch4的表達,其表達的強度不一,肝癌組織中Notch1的表達量會明顯的升高,且Notch1的表達與腫瘤的大小、局部的侵潤、腫瘤的轉移有關[7-8]。目前有關Notch1信號通路調控肝癌細胞的生長增殖的機制尚不明確。Notch的靶基因包括Hes和Hey兩大基因家族,Hes1在感覺系統、內分泌細胞及淋巴細胞的生長發育中起到關鍵的作用,其對肝癌細胞生長增殖的影響可能與調控下游Hes1和Hes2的表達水平,引起細胞周期的停滯,從而影響肝癌細胞的生物學行為[9]。Notch信號通路具有雙向的調控作用,既可以促進癌癥細胞的生長,亦可抑制癌癥細胞的生長,其在不同的腫瘤發展的不同階段其調控的機制可能不同,從而使得有時抑制,有時促進腫瘤細胞的生長。這種雙向調控主要與細胞周圍所處的維環境的不同和Notch受體的數量和種類有關[10]。

本實驗結果表明,模型組和ESB低、高劑量組大鼠的體質量較空白組明顯降低,肝表面的癌結節數較空白組明顯升高,確定黃曲霉素B1誘導大鼠癌變成功。經過ESB灌胃之后,ESB低、高劑量組的體質量、癌結節數均明顯改善,且Notch1較模型組明顯降低,表明ESB在一定程度上能夠緩解黃曲霉素B1誘導大鼠肝癌的程度,其作用的機制可能與下調Notch1表達有關。

[1]Wang S,Zheng Z,Weng Y,et al.Angiogenesis and antiangiogenesisactivity ofChinese medicinal herbal extracts[J].Life Sci,2004,74(20):2467-2478.

[2]代志軍,劉小旭,湯薇,等.半枝蓮提取物對H22荷瘤小鼠免疫功能的影響及其抑瘤作用[J].南方醫科大學學報,2008,28(10):1835-1837.

[3]葉勝龍.2013年肝癌領域新進展[J].中華肝臟病雜志,2014,22(1):2-4.

[4]陳志英,嚴瑞琪,覃國忠,等.建立黃曲霉毒素Bl致肝癌作用短期體內實驗模型的進一步研究[J].廣西醫學院學報,1985,2(3):17-19.

[5]馬健.黃曲霉毒素及其致病機制簡述[J].中國牛業科學,2012,38(1):43-45.

[6]Yin X,Zhou J,Jie C,et al.Anticancer activity and mechanism ofScutellariabarbara extract on human lung cancer cell line A549[J].Life Sci,2004,75(18):2233-2244.

[7]Sarbjit S.Nijjar,Heather A.Crosby,Lorraine Wallace,et al.Notch receptor expression in adult human liver：a possible role inbile duct formation and hepatic neovascularization[J].Hepatology,2001,34(6):118-1192.

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[10]Hu XB1,Feng F,Wang YC,et al.Blockade of Notch signaling in tumor-bearing mice may lead to tumor regression，progression，or metastasis，depending on tumor cell types[J].Neoplasia,2009,11(1):32-38.

(2014-04-06收稿 責任編輯：王明)

Effects of Banzhilian Extract on Notch1 of Aflatoxin B1-induced Hepatic Carcinoma

Cai Linxue1,Liu Shunan2

(1DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,CollegeofPharmacy,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004; 2thePeople'sLiberationArmy476Hospital,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion,Fuzhou,350001)

Objective: To investigate the Banzhilian extract's effects on Notch1 of rats with aflatoxin B1-induced hepatic carcinoma.Methods: Sixty Wistar rats were randomly divided into 4 groups: normal control group,hepatocarcinoma model group,extract's high dose group and low dose group.Hepatic carcinoma model were induced by aflatoxin B1.The control group and the model group were given distilled water lavagely,the extract's groups were given different concentrations of extracts lavagely,qd.for a month.All rats were killed in the 4th week,measure weight,counted number of nodules on the surface of liver.Immunohistochemistry were used to detect the expression of Notch1.Results: Compared with the control group,the rats' weight in other groups dropped significantly (P<0.05),while the nodule number and Notch1 levels increased significantly (P<0.05); Compared with the model group,the rats' weight in the extract's of high dose group and low dose group were increased (P<0.05),while the nodule number and Notch1 levels were reduced considerably(P<0.05).Conclusion: Banzhilian extract could inhibit aggravation of liver carcinoma,which is probably related to the down-regulating of liver Notch1.

Banzhilian; Aflatoxin B1;Hepatic carcinoma; Notch1

福建省自然科學基金項目(編號:2012J01131)

R284.2;R273

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.022