松針對呼吸道合胞病毒感染小鼠肺組織TLR3、TLR4表達的影響

王 杰 張文斌 牟 界 雷文匯 李 芹

(重慶市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶,400010)

松針對呼吸道合胞病毒感染小鼠肺組織TLR3、TLR4表達的影響

王 杰 張文斌 牟 界 雷文匯 李 芹

(重慶市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科,重慶,400010)

目的:通過觀察松針對呼吸道合胞病毒感染小鼠肺組織Toll樣受體3(TLR3)及Toll樣受體4(TLR4)蛋白表達的影響,探討其治療呼吸道合胞病毒感染的可能免疫調(diào)節(jié)機制。方法:采用美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research)培育的ICR小鼠60只隨機分為6組:正常對照組、模型組、利巴韋林組、松針高劑量組、中劑量組呼、低劑量組,呼吸道合胞病毒滴鼻后給藥,觀察肺組織TLR3及TLR4蛋白的表達。結(jié)果:松針高劑量組可降低小鼠肺組織TLR3及TLR4蛋白的表達,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:松針可抑制呼吸道合胞病毒感染小鼠肺組織中TLR3及TLR4蛋白的表達,可能為其免疫調(diào)節(jié)作用的機制之一。

松針;呼吸道合胞病毒感染;TLR3;TLR4

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Viral,RSV)是副黏病毒科肺炎病毒屬,有包膜非片段性的單股負(fù)鏈RNA病毒,是導(dǎo)致嬰幼兒呼吸道感染最重要的病毒病源。目前醫(yī)學(xué)尚無特效的抗RSV藥物,相關(guān)疫苗開發(fā)也尚未成熟[1]。Toll樣受體(Toll Like Receptors,TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)在抗病原微生物免疫防御反應(yīng)中起重要作用的蛋白,通過識別病原微生物的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated Molecular Patterns,PAMPs),從而啟動天然免疫調(diào)節(jié)性免疫反應(yīng)[2],是機體天然免疫的重要組成部分。中醫(yī)藥具有一定的免疫調(diào)節(jié)機制被人們廣泛認(rèn)可,在臨床中我們觀察到松針治療本病有明顯優(yōu)勢,具有清肺、化痰、止咳等一系列抗RSV感染的治療方法,并取得良好的臨床療效[3],為治療嬰幼兒RSV肺炎提供了新的思路。本實驗旨在探討松針在治療該病上的免疫調(diào)節(jié)作用可能的機制。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑 ICR小鼠60只,體重13～16 g,雌雄各半,由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,利巴韋林(四川美大康藥業(yè)股份有限公司提供,批號:091139);TLR3及TLR4單克隆抗體(Santa Cruz公司,美國);呼吸道合胞病毒A亞型Long株(國家典型培養(yǎng)物保藏中心)。松針的制備:采用2010年版中華人民共和國藥典附錄制備方法,采摘3～5年以上樹齡的松針,每次選取50支鮮松針洗干凈,切成長度1 cm左右,加水2小杯由榨汁機進行鮮窄,研磨成汁液,以大火煎開,文火水煎2次過濾去渣,合并水煎液后在中藥液體包裝機中濃縮成含生藥3 g/mL溶液作為灌胃劑量,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及上呼吸道感染模型制備[4]ICR

小鼠50只,隨機等分成5組:正常對照組、模型組、抗病毒口服液組、利巴韋林組、松針組,每組10只。給藥當(dāng)日,乙醚的輕度麻醉下,正常對照組小鼠以生理鹽水滴鼻,每鼠30 μL。其余各組以呼吸道合胞病毒滴鼻感染,每鼠30 μL。

1.2.2 治療給藥 感染0.5 h后,給藥情況:正常組(等量生理鹽水)、模型組(等量生理鹽水)、抗病毒口服液組(10 mL/kg)、利巴韋林組(150 mg/kg)、松針(37.66 g/kg),各組給藥的體積均為0.2 mL/10 g,給予灌胃給藥，1次/d,連續(xù)7 d。

1.2.3 觀察指標(biāo) 各組小鼠于末次給藥后,冰浴條件下無菌迅速摘取小鼠肺臟,置于無RNase EP管中,立即投入液氮中冷凍。每組取6個肺組織。用western blot法檢測肺組織中TLR3及TLR4蛋白的表達水平。

圖1 模型組與對照組比較

圖2 松針各劑量組與模型組、對照組比較

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計處理,所有western blot實驗數(shù)據(jù)至少進行3次獨立實驗,通過檢測基因與內(nèi)參β-actin的比值,采用單因素方差分析,LSD法進行兩兩比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

松針對上呼吸道感染小鼠肺組織TLR3及TLR4蛋白的表達水平的影響:呼吸道合胞病毒模型組小鼠與正常對照組比較,肺組織中的TLR3及TLR4蛋白的表達水平表達顯著增強,二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1A、B)。經(jīng)藥物治療后,松針高劑量組的TLR3及TLR4蛋白的表達降低,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明松針對呼吸道合胞病毒引起的上呼吸道感染的免疫調(diào)節(jié)作用可能與降低肺組織中TLR3及TLR4蛋白的表達有關(guān)(圖2A、B)。

3 討論

呼吸道合胞病毒(RSV)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒病毒性下呼吸道感染最重要的病毒病原,目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無特效的抗RSV藥物,相關(guān)疫苗的開發(fā)也尚未成熟[5]。Delgado M F等提出,滅活的RSV疫苗是確保嬰幼兒接種疫苗安全性的關(guān)鍵因素,因其通過Toll樣受體(Toll-like Receptors，TLR)的刺激可增強保護性抗原表位的抗體親和力[6]。而中醫(yī)藥以天然藥物的抗病毒優(yōu)勢,提出清肺、化痰、止咳等一系列抗RSV感染的治療方法,并取得良好的臨床療效,為治療嬰幼兒RSV肺炎提供了新的思路[7]。研究表明,RSV可能激活TLR4受體,然而沒有明確的證據(jù)表明RSV F蛋白可以單獨刺激TLR4依賴的NF-κB通路的激活。近年來有研究發(fā)現(xiàn)RSV型肺炎的免疫反應(yīng)依賴完整的TLR4或MyD88信號通路。認(rèn)為在RSV感染細(xì)胞中,通過LPS激活的人TLR4是不受影響的[8]。因此,RSV顆粒和人類TLR4受體之間復(fù)合物的直接相互作用似乎在RSV肺炎的發(fā)病機制中不發(fā)揮生物學(xué)作用。研究表明TLR4信號通路需要通過IFN-β調(diào)節(jié)IL-4，IL-13，IL-4Rα和IL-10的表達,使PPARγ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞,從而回應(yīng)RSV[9]。RSV識別潛在的TLR3、TLR4通路從而激活人類骨髓樹突狀細(xì)胞,進而影響免疫。通過激活TLR3,影響病毒的發(fā)病機制和肺TLR的表達,證實了毒干擾素和肺部炎性反應(yīng)的關(guān)聯(lián),并表明IFN的動物模型與肺炎的病因病理變化有著潛在的聯(lián)系[10]。TLRs中TLR3是在人支氣管上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞中參與干擾素反應(yīng)的主要受體。證實TLR3通過檢測病毒RNA參與RSV引起的肺部炎性反應(yīng),這可能導(dǎo)致病毒感染,并參與多種TLRs的炎性反應(yīng)[11]。

TLR是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。在TLRs中,Toll樣受體3(TLR3)和Toll樣受體4(TLR4)與RSV關(guān)系最為密切。當(dāng)RSV病毒入侵時,TLR3可識別RSV復(fù)制過程中雙鏈RNA(dsRNA),通過非依賴的信號通路途徑,結(jié)合到TRIF介導(dǎo)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo),激活I(lǐng)RF-3和(或)核因子κB(nuclearfactor kappa-B,NF-κB),刺激誘導(dǎo)大量IFN-α/β及其他細(xì)胞因子表達,大量IFN的分泌激活有利于局部抗病毒狀態(tài)的建立,從而限制病毒在感染部位的復(fù)制,研究表明,在RSV感染上皮細(xì)胞過程中,TLR4通過引起LPS介導(dǎo)的IL-6反應(yīng)起作用,且可能是影響上皮細(xì)胞趨化因子與病毒和內(nèi)毒素相互作用的一個重要因素[12]。通過信號通路下游的接頭蛋白如NF-κB、AP-1等引起炎性因子或抗炎因子如白介素-6、-8、-12(interleukin-6、-8、-12,IL-6、IL-8、IL-12)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素-α(interferon-α,IFN-α)等的表達而發(fā)揮作用,除此之外,TLR4也可通過TRIF/TRAM依賴性信號通路,激活由脂多糖(LPS)介導(dǎo)所致的各種細(xì)胞炎性反應(yīng)[13]。

近年來中藥治療該病有了一定的進展。同時在臨床中,我們運用松針治療該病,取得了良好的臨床療效,松針在歷代本草中均有記載,《別錄》謂:其“主風(fēng)濕瘡,生毛發(fā),安五臟”?！侗静菥V目》記載:“松柏為百木之長”,服之“令人不老,輕身益氣,不饑延年”。現(xiàn)代研究表明松針具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、延緩衰老、降血脂、降膽固醇等作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示,模型組小鼠與正常對照組比較,肺組織中的顯著增強,二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明感染后,激活機體免疫系統(tǒng),使得TLR3及TLR4蛋白表達增強。經(jīng)藥物治療后,松針高劑量組的TLR3及TLR4蛋白表達降低,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明松針對呼吸道合胞病毒感染的免疫調(diào)節(jié)作用可能與降低肺組織中TLR3及TLR4蛋白的表達有關(guān),推測其機制可能是通過抑制RSV感染后肺部病毒滴度,減少RSV在體內(nèi)的復(fù)制。

研究表明中藥松針在抑制RSV有其獨有的優(yōu)勢,然而松針在病毒基因?qū)W、免疫學(xué)的有機結(jié)合尚待研究,我們?nèi)孕枰钊胩接懫淇筊SV的作用途徑及其作用機制。中藥松針對RSV抑制作用的實驗研究為松針治療RSV感染型肺炎提供了技術(shù)支撐,由此可見,中醫(yī)藥治療RSV肺炎療效明顯,具有一定的開發(fā)運用前景。

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(2014-11-14收稿 責(zé)任編輯：王明)

The Effective of Pine on the Expression of TLR3,TLR4 of Respiratory Syncytial Virus Infection in Mice

Wang Jie,Zhang Wenbin,Mu Jie,Lei Wenhui,Li Qin

(RespiratoryDepartmentofInternalMedicine,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,ChongqingYuzhongDistrict,400010)

Objective: To observe the effect of pine in respiratory syncytial virus infection in the expression of TLR3 lung tissue and TLR4 protein in mice,and explore the immune regulation mechanism of the treatment of respiratory syncytial virus infection.Methods: 60 ICR mice were randomly divided into 5 groups: normal control group,model group,the antiviral oral liquid group,ribavirin,and pine needles.After intranasal administration of respiratory syncytial virus,observe TLR3 lung tissue and the expression of TLR4 protein.Results: The antiviral oral liquid,ribavirin,pine needles can reduce the TLR3 and the expression of TLR4 protein of lung tissue in mice,compared with model group with significant difference (P<0.05).Conclusion: Pine needles can inhibit the respiratory syncytial virus infection in the lung tissue of mice TLR3 and the expression of TLR4 protein,and may be one of the mechanisms of immune regulation.

Pine needles; Respiratory syncytial virus infection; TLR3; TLR4; Protein

國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項(編號:JDZX2012062)

王杰(1977.9—),男,碩士研究生,主治醫(yī)師,E-mail:why9955@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.023