慢性乙型肝炎舌紅苔黃和舌淡苔白不同舌象的尿代謝組研究

趙 瑜 茍小軍 戴建業(yè) 徐 琳 彭景華 馮 琴 張永煜 胡義揚(yáng)，3，4

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，上海，201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203； 3 上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，上海，201203； 4 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，201203)

慢性乙型肝炎舌紅苔黃和舌淡苔白不同舌象的尿代謝組研究

趙 瑜1茍小軍1戴建業(yè)2徐 琳1彭景華1馮 琴1張永煜2胡義揚(yáng)1，3，4

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，上海，201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203； 3 上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，上海，201203； 4 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，201203)

目的：探索慢性乙型肝炎舌紅苔黃和舌淡苔白不同舌象者的尿代謝差異指標(biāo)，為中醫(yī)舌象生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)微觀辨證提供證據(jù)。方法：采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)技術(shù)方法獲取慢性乙型肝炎舌紅苔黃和舌淡苔白不同舌象者的尿液樣本代謝指紋譜，用無監(jiān)督的學(xué)習(xí)模式進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，觀察不同組別的人群之間是否存在“自然”的分類結(jié)構(gòu)。利用有監(jiān)督的學(xué)習(xí)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)分類模型的建立和檢驗(yàn)，尋找造成樣本聚集和離散的主要差異變量。利用商業(yè)化的代謝物譜庫以及標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行物質(zhì)鑒定。結(jié)果：慢性乙型肝炎舌紅苔黃和舌淡苔白者在有監(jiān)督的學(xué)習(xí)模式下具有良好的分開趨勢，慢乙肝不同舌象者較健康者的差異代謝物譜主要與能量代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝以及腸道菌群代謝相關(guān)。結(jié)論：舌象是機(jī)體變化的重要窗口，不同舌象的外在表觀潛在體內(nèi)的代謝差異。

舌象；慢性乙型肝炎；代謝組；物質(zhì)基礎(chǔ)

舌象是機(jī)體變化的重要窗口，是中醫(yī)核心證素之一。舌診是通過觀察舌以達(dá)到診察疾病的目的，其歷史悠久早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有望舌診病的記載。望舌可以察疾病的性質(zhì)、病邪的淺深，邪正的消長，有謂“審苔垢即知邪之寒熱淺深”《醫(yī)門棒喝》。由于舌象的直觀性、客觀性，其中醫(yī)臨床辨證的實(shí)用價(jià)值越來越受到推崇。研究證實(shí)正確的舌診可指導(dǎo)臨床決策并提高臨床療效，這一點(diǎn)也逐步被一些西方學(xué)者接受和共識(shí)，并應(yīng)用在一些疾病的早期診斷中[1-3]。

中醫(yī)學(xué)舌診不同舌象的生物學(xué)基礎(chǔ)如何是一重要的科學(xué)問題。近年來，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段，從形態(tài)學(xué)、微生態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等不同角度著手探討舌苔形成和變化的機(jī)制，取得了一定的成果[4-7]。隨著系統(tǒng)生物學(xué)和信息分析技術(shù)的發(fā)展以及在中醫(yī)領(lǐng)域的研究不斷深入，目前，已有部分學(xué)者采用代謝組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)或元基因組學(xué)方法探索舌苔的生物學(xué)基礎(chǔ)[8-9]，提示運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)方法，可以揭示舌象變化的內(nèi)涵，為舌象研究探索了良好的技術(shù)途徑。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為舌象變化離不開身體的內(nèi)環(huán)境，舌象是機(jī)體變化的重要窗口，所謂“有諸于內(nèi)，必形諸于外”。舌與臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血、津液具有密切聯(lián)系，《形色簡摩·舌質(zhì)舌苔辨》曰：“苔乃胃氣之所熏蒸，五臟皆稟氣于胃，故可借以診五臟之寒熱虛實(shí)也。”除舌的本體物質(zhì)基礎(chǔ)研究之外，舌象與整體內(nèi)環(huán)境的關(guān)系有待探討。因此，本研究從慢性乙型肝炎患者最常見的舌紅苔黃和舌淡苔白兩種舌象著手，檢測上述舌象者的尿液代謝物譜，探討不同的舌象表觀是否存在機(jī)體內(nèi)在的代謝差異。

1 材料方法

1.1 臨床病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合慢性乙型肝炎疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)者；2)舌象辨證為舌紅苔黃或舌淡苔白者；3)年齡18～65周歲；4)簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1)年齡<18歲或>65歲；2)合并其他嗜肝病毒感染、自身免疫性疾病等其他肝臟疾病；3)慢性重型肝炎；4)伴有心、腎、肺、內(nèi)分泌、血液、代謝及胃腸道嚴(yán)重原發(fā)病者；5)或精神病患者、孕婦或哺乳期婦女。

慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)參考“2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)制定的慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)”[10]。舌象診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《中醫(yī)診斷學(xué)》[11]。

1.2 舌象信息采集 根據(jù)《中醫(yī)診斷學(xué)》中舌診的內(nèi)容制定舌象觀察表，包括記錄舌色、舌形、苔質(zhì)、苔色、舌下脈絡(luò)等內(nèi)容。慢乙肝患者溫水漱口10 min后，先肉眼觀察記錄患者舌象，然后采用舌像儀(DAOSH，ZBOX)拍攝志愿者舌象，將圖象輸入計(jì)算機(jī)，同時(shí)記錄患者臨床病情，辨證結(jié)果由3名主治醫(yī)師共同確認(rèn)。

1.3 代謝組樣本檢測及信息分析

1.3.1 尿樣的收集及處理 在樣本收集前一天叮囑患者清淡飲食，禁止吸煙、喝酒，減少食物對(duì)代謝造成的波動(dòng)。留取晨尿約5 mL置10 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上層液置于-70 ℃冰箱保存。

實(shí)驗(yàn)前2 h將尿液樣品取出，室溫下解凍搖勻，取1.0 mL尿液樣品于離心管中，12 000 r/min離心10 min；取上清液200 μL于1.5 mL離心管中，振蕩30 s，在37 ℃反應(yīng)15 min去除尿素；加入800 μL的A和10 μL的B，振蕩1 min；13 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL于GC瓶中，在室溫氮?dú)饬鞔蹈桑患尤?0 μL的C，封蓋，振蕩1 min，在30 ℃的搖床(200 r/min)下反應(yīng)90 min進(jìn)行甲氧氨對(duì)羰基的封閉反應(yīng)，啟蓋；加入50 μL的D，封蓋，振蕩30 s；在70 ℃的烘箱中反應(yīng)60 min，振蕩30 s，啟蓋，加入40 μL的庚烷，封蓋，振蕩30 s即可。

1.3.2 代謝組學(xué)檢測及數(shù)據(jù)分析 采用GC/MS技術(shù)方法獲取尿液樣本代謝指紋譜。將每個(gè)樣本的原始數(shù)據(jù)通過DataBridge(PerkinElmer Inc，USA)軟件轉(zhuǎn)換為NetCDF格式，導(dǎo)入到XCMS toolbox程序包中，自動(dòng)執(zhí)行基線校正，峰辨識(shí)，峰對(duì)齊及中心化等過程，最終得到一個(gè)三維矩陣表，將該文件導(dǎo)入SIMCA-P11.0軟件中進(jìn)行模式識(shí)別和多維統(tǒng)計(jì)分析。用無監(jiān)督的學(xué)習(xí)模式,如主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，觀察不同組別間是否存在“自然”的分類結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，利用有監(jiān)督的學(xué)習(xí)模式包括偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)、正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)等，進(jìn)行數(shù)據(jù)分類模型的建立和檢驗(yàn)。依據(jù)P值小于0.05，VIP>1.0(重要變量投影系數(shù))的原則，尋找造成樣本聚集和離散的主要差異變量。經(jīng)商業(yè)化的代謝物譜庫以及標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫匹配鑒定相對(duì)應(yīng)的化合物，結(jié)合HMDB以及KEGG數(shù)據(jù)庫搜庫結(jié)果，得到各組間相互比較的慢性乙型肝炎舌紅苔黃、舌淡苔白者特征性尿代謝物譜。

2 結(jié)果

2.1 臨床信息分析 共收集慢性乙型肝炎典型的舌紅苔黃與舌淡苔白舌象者每組各50例，另收取淡紅舌薄白苔的健康志愿者25例為對(duì)照，各組臨床基礎(chǔ)信息及生化指標(biāo)基線見表1，慢乙肝舌紅苔黃與舌淡苔白組間臨床信息無差異。

2.2 慢性乙型肝炎不同舌象組尿代謝分析 對(duì)比不同舌象志愿者尿樣本的GC/MS色譜圖，三組間的尿代謝物譜差異明顯，經(jīng)NIST譜庫和標(biāo)準(zhǔn)品鑒定后確定的內(nèi)源性代謝物包括：氨基酸類，核苷類，碳水化合物類，不飽和脂肪酸類等。對(duì)慢性乙型肝炎舌紅苔黃組和舌淡苔白組以及健康志愿者的尿代謝物譜進(jìn)行PCA分析見圖1，在無監(jiān)督狀態(tài)下各組尿代謝物譜區(qū)分情況不理想。進(jìn)一步篩選慢性乙型不同舌象組分類的關(guān)鍵變量，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS分析，經(jīng)7重交叉驗(yàn)證，模型的R2Y=0.89，Q2Y=0.67。分類結(jié)果如圖2所示，各組具有良好的分開趨勢。

表1 各組臨床信息分析 中位數(shù)(最小值-最大值)

注：*慢乙肝各組vs健康組P<0.05。

圖1 慢性乙型肝炎舌紅苔黃組、舌淡苔白組 和健康組尿代謝PCA得分圖

圖2 慢性乙型肝炎舌紅苔黃組、舌淡苔白組 和健康組尿代謝OPLS得分圖

2.3 特征性代謝物譜鑒定 基于OPLS分析結(jié)果，篩選VIP值>1，P<0.05的峰值得到對(duì)慢乙肝舌紅苔黃和舌淡苔白組分類的關(guān)鍵變量，經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫以及標(biāo)準(zhǔn)品鑒定，得到慢性乙型肝炎舌紅苔黃與舌淡苔白不同舌象的特征性尿代謝物譜，詳見表2。

3 討論

與正常舌象者相比較，慢乙肝舌紅苔黃和舌淡苔白患者較健康志愿者的代謝差異主要集中在能量代謝、氨基酸代謝和菌群代謝三大模塊。舌紅苔黃者的尿樣本景天庚酮糖濃度顯著增加，丙酸，乙二酸，D-葡糖酸和β-D-吡喃葡萄糖苷濃度顯著減少，舌淡苔白者尿液中D-甘露糖，肌-肌醇及景天庚酮糖的水平顯著增加，而丁二酸，乙二酸的水平顯著下降，上述差異代謝物與能量代謝相關(guān)[12-13]。中醫(yī)認(rèn)為正常的舌象提示胃氣旺盛，氣血津液充盈。脾胃同居中焦，而脾主運(yùn)化，是人體消化、吸收食物，對(duì)精微輸布的主要臟器，人體化生和充實(shí)精氣血津液均有賴于脾胃的運(yùn)化作用。《素問·玉機(jī)真藏論》曰：“脾為孤臟，中央土以館四傍”，故稱脾胃為“后天之本”。所謂“見肝之病，則知肝當(dāng)傳之于脾，當(dāng)先實(shí)其脾氣”，當(dāng)肝氣橫逆犯脾，脾氣虛弱導(dǎo)致運(yùn)化不足成為上述能量代謝紊亂的可能原因。

與健康組相比，舌紅苔黃組尿樣本中甘氨酸、半胱氨酸、色氨酸水平增加，舌淡苔白組半胱氨酸、色氨酸升高。半胱氨酸和甘氨酸是谷胱甘肽的組成成分，色氨酸是必需氨基酸的一種，維持正常的細(xì)胞代謝，并參與蛋白質(zhì)的合成[14]。當(dāng)肝細(xì)胞受損，游離色氨酸釋放增加，可顯著影響肝臟疾病在體內(nèi)色氨酸代謝狀態(tài)[15]。上述代謝物在兩舌苔組之間分布無差異，因此，推測該變化一定程度上體現(xiàn)了慢性乙型肝炎的疾病代謝特性。

較健康組，慢乙肝舌紅苔黃和舌淡苔白組尿樣本苯甲酸含量均升高，而舌淡苔白組較舌紅苔黃組丁酸，乙酸，2,3-二羥基丁酸尿代謝量升高。苯甲酸，丁酸，乙酸，2,3-二羥基丁酸的變化與菌群代謝相關(guān)。苯甲酸，屬于含苯基化合物，是腸道菌群的代謝產(chǎn)物的代謝，來源于從食物中的多酚和蛋白質(zhì)分解而來的芳香族氨基酸[16]。丁酸，乙酸和2,3-二羥基丁酸為短鏈脂肪酸，主要來源于盲腸或結(jié)腸微生物對(duì)膳食纖維素，淀粉及其他未消化物質(zhì)的發(fā)酵[17]。最新研究發(fā)現(xiàn)舌苔的形成與疾病狀態(tài)下的口腔微環(huán)境密切相關(guān)，舌苔一定程度上是人體在病理狀態(tài)下，對(duì)口腔正常微生物的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)的反映[18-19]。在中醫(yī)理論中，舌淡苔白多與濕濁痰飲內(nèi)停，食積胃腸有關(guān)，屬脾胃運(yùn)化不利的表現(xiàn)，因此，其菌群相關(guān)物代謝譜差異可能與脾胃失調(diào)，運(yùn)化失職密切相關(guān)。此外，慢乙肝舌淡苔白組較健康組偽尿苷水平升高，雖然有研究認(rèn)為尿液中的偽尿苷是惡性腫瘤的早期診斷標(biāo)志物，但與舌苔生物學(xué)內(nèi)涵的關(guān)系仍不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎舌紅苔黃和舌淡苔白者有明確的特征性尿代謝物譜，提示中醫(yī)證候具有整體性，舌象的“外在”表現(xiàn)潛在體內(nèi)的代謝差異，為中醫(yī)舌象生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)微觀辨證提供了參考依據(jù)。

表2 慢性乙型肝炎舌紅苔黃組、舌淡苔白組特征性代謝物譜表

注：Fc(fold change)：表示代謝物濃度相對(duì)增加和減少的倍數(shù)；*P<0.05，**P<0.01：VS健康人淡紅舌薄白苔組；##P<0.01，#P<0.05：慢乙肝舌紅苔黃組VS舌淡苔白組；NS：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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(2014-12-26收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Urinary metabolic signatures of chronic hepatitis B patients with different tongue manifestations

Zhao Yu1, Gou Xiaojun1, Dai Jianye2, Xu Lin1, Peng Jinghua1, Feng Qin1, Zhang Yongyu2, Hu Yiyang1,3,4

(1InstituteofLiverDiseases,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 3E-instituteofShanghaiMunicipalEducationCommittee,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China;4KeyLaboratoryofLiverandKidneyDiseases(ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine),MinistryofEducation,Shanghai201203,China)

Objective:Exploring the urinary metabolic profiling of chronic hepatitis b (CHB) patients with different tongue manifestations, the red tongue with yellow tongue coating and the pale tongue with white tongue coating, to demonstrate the potential objective material basis. Methods: The urinary metabolic profiling was detected based on gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS), multivariate data was analyzed, the unsupervised segregation and supervised segregation analysis were checked, and the potential markers of interest were extracted and confirmed. Results: Distinct clustering in metabolic profiles were observed by supervised segregation analysis in different tongue groups, based on the variable of importance(VIP) in the project values, significantly changed metabolites were identified. These changes were related to the disturbance in energy metabolism, amino acid metabolism, nucleotide metabolism, and gut microflora metabolism. Conclusion: This study demonstrated that tongue manifestation may have objective material basis, and closely related to the condition of the body organs function.

Tongue manifestation; Chronic hepatitis b; Metabolome; Material basis

國家十二五重大科技專項(xiàng)(編號(hào)：2012ZX10005001-004)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81373857，81403298)；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：14ZR1442000)

R241.25

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.008