HPLC法同時測定痛經貼劑中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量

張麗君，田 軍，劉 永

(1．安徽中醫藥大學，安徽合肥 230012;

2．安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽合肥 230051)

痛經貼劑由枳殼、陳皮、赤芍、當歸、延胡索、冰片等八味中藥組成，具有行氣止痛，活血化瘀的功效，用于治療氣滯血瘀型原發性痛經。本方中枳殼和陳皮同屬蕓香科植物，具有理氣作用，故作為君藥。柚皮苷、新橙皮苷為枳殼主要有效成分，橙皮苷為陳皮主要有效成分，且柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷均屬黃酮類成分［1－3]。為有效控制痛經貼劑的質量，本實驗采用高效液相色譜法同時對柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷進行測定并進行了方法學考察，方法簡單、可靠、穩定性好。

1 儀器與試藥

島津LC-10AT型高效液相色譜儀(單元泵，SPD紫外檢測器，島津 LC solution Lite色譜工作站);TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);As3120B型超聲波清洗器(北京恒奧德儀器儀表有限公司);METTLER TOLEDO XS105型電子天平(鄭州龍騰達儀器設備有限公司)。柚皮苷對照品(批號:110722－200108);橙皮苷對照品(批號:110721－200512);新橙皮苷對照品(批號:111857－201102)均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水;其它試劑均為分析純。痛經貼劑，自制，批號分別為:20141218、20141226、20150112。

2 方法與結果

2．1 色譜條件 色譜柱:Cosmosil-C18色譜柱(5 μm，4．6 mm × 250 mm);流動相:乙腈—0．1% 磷酸(21∶79);流速:1．0 mL · min－1;檢測波長:分別取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對照品液適量，在200～400 nm波長范圍內掃描，并參考藥典，最終確定最大吸收波長為283 nm;柱溫:25℃;進樣量:10 μL。

2．2 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含柚皮苷80μg、橙皮苷60μg、新橙皮苷60μg的混合溶液，即得混合對照品溶液。

2．3 供試品溶液的制備 本品貼劑除去蓋襯，取約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1．5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2．4 空白溶液的制備 根據處方組成，取除枳殼和陳皮外的其余藥材，按制備工藝要求制備不含枳殼和陳皮的空白樣品，照“2．3”項下方法制備空白溶液，精密吸取10μL，按上述色譜條件進行測定，結果在柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷位置未見峰出現，表明空白溶液對樣品測定無干擾。測定結果見圖1。

2．5 對照品精密度試驗 取“2．2”項下的混合對照品溶液，按上述色譜條件進行測定，連續進樣6次，結果柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面積RSD分別為 1．035%、1．716%和 0．899%，表明本法對照品精密度良好。

2．6 線性范圍考察 精密稱取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含柚皮苷 0．34 mg、橙皮苷 0．25 mg、新橙皮苷 0．26 mg的混合對照品溶液，采用等比稀釋法，即從10 mL上述對照品溶液中取5 mL，用甲醇定容至10 mL，再從10 mL中取5 mL用甲醇定容至10 mL，依次操作，分別得含柚皮苷 340、170、85、42．50、21．25、10．63 mg·L－1，橙皮苷 250、125、62．50、31．25、15．63、7．81 mg· L－1和新橙皮苷 260、130、65、32．50、16．25、8．13 mg·L－1的 6 份混合對照品溶液，按“2．1”項下色譜條件注入液相色譜儀進行測定，記錄峰面積。以對照品進樣量(μg)為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y進行線性回歸，得線性回歸方程:柚皮苷 Y=18 015X －23 049，r=0．999 9(n=6);橙皮苷 Y=19 172X －20 620，r=0．999 9(n=6);新橙皮苷 Y=20 985X －23 203，r=0．999 9(n=6)。結果表明:柚皮苷在 10．63 ～340 mg·L－1濃度范圍內線性關系良好，橙皮苷在7．81～250 mg·L－1濃度范圍內線性關系良好，新橙皮苷在8．13～260 mg·L－1濃度范圍內線性關系良好。

2．7 供試品精密度試驗 取同一批號(批號:20141218)供試品，按“2．3”項下制備供試品溶液，再按“2．1”項下色譜條件注入液相色譜儀，連續進樣6次，結果柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面積RSD 分別為1．02%、1．29%和1．94%，表明本法供試品精密度良好。

2．8 重復性試驗 取同一批(批號20141218)痛經貼劑樣品，按“2．3”項下供試品溶液制備方法制備6份供試液，按“2．1”色譜條件注入液相色譜儀進行測定，并按外標法以峰面積計算含量，結果柚皮苷的含量為 6．09、6．05、5．97、5．81、5．89、5．97 mg·g－1，平均值為5．96 mg·g－1;橙皮苷的含量為5．23、5．14、5．1、5．14、5．01、5．06 mg·g－1，平均值為5．11 mg · g－1;新橙皮苷的含量為 3．76、3．72、3．66、3．85、3．8、3．82 mg·g－1，平均值為 3．77 mg·g－1。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的溶液含量的RSD分別為1．71%、1．48% 和 1．86%，表明本法重現性良好。

2．9 穩定性試驗 取同一批(批號20141218)的供試品溶液，分別于 0、1、2、4、6、8 h，按“2．1”項下色譜條件測定，記錄其峰面積，結果柚皮苷的峰面積分別為 2 253 621、2 272 347、2 317 384、2 255 391、2 282 744、2 203 981，平均值為 2 264 245;橙皮苷的峰面積為2 143 612、2 160 111、2 155 815、2 086 990、2 202 010、2 127 881，平均值為 2 146 070;新橙皮苷的峰面積為 1 640 164、1 651 908、1 650 799、1 582 536、1 608 589、1 598 429，平均值為 1 622 071。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面積RSD分別為1．65%、1．78% 和 1．83%。結果表明，供試品溶液在8 h內穩定。

2．10 加樣回收率試驗 精密稱取除去蓋襯的同一批號已知含量的痛經貼劑(批號20141218，柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量分別為5．86 mg·g－1、5．04 mg · g－1和3．68 mg · g－1)6 份，每份約0．5 g，置錐形瓶中，再分別加入柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷濃度分別為 0．312 4、0．263 2 和 0．185 8 mg·mL－1的對照品混合溶液10 mL，精密加入甲醇40 mL，稱定重量，加熱回流1．5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，按“2．1”項下色譜條件進行測定，計算回收率。結果見表1～3。

表1 柚皮苷加樣回收率(n=6)

表2 橙皮苷加樣回收率(n=6)

表3 新橙皮苷加樣回收率(n=6)

2．11 樣品測定 取本品樣品 3批(批號:20141218，20141226，20150112)，按“2．3”項下制備供試品溶液，按“2．1”項下色譜條件測定，3批樣品中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量結果見表4。

表4 柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量測定結果

3 討論

3．1 波長的選擇 藥典2010版一部枳殼、陳皮采用高效液相色譜法測定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量，測定波長均為283 nm，且采用紫外分光光度計在200～400 nm波長范圍內掃描，結果顯示柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷均在283 nm下有最大吸收，參考相關文獻［4－5]，最終確定選擇283 nm為最大測定波長。

3．2 流動相的選擇 分別對甲醇—醋酸—水［6－8]和乙腈—0．1%磷酸［9－11]兩種流動相的不同比例進行了考察，結果甲醇—醋酸—水系統為流動相時橙皮苷峰形較寬，且新橙皮苷峰與雜質峰分離效果較差，當甲醇—醋酸—水比例為(35∶1∶64)時，新橙皮苷峰分離效果較好，但出峰時間較長，而乙腈—0．1%磷酸系統為流動相時出峰時間短，峰形和分離度都較好，通過對其流動相不同比例進行比較，結果表明柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在乙腈—0．1%磷酸(21∶79)流動相下的峰形、分離度和出峰時間都較為理想，且空白對照無干擾。

3．3 提取方法的選擇 分別比較了用甲醇超聲提取［12－13]30、60 和90 min 及用甲醇加熱回流提取［14]30、60和90 min，根據柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量測定結果，最終確定用甲醇加熱回流提取90 min，可將這三種成分提取的比較完全。

3．4 柱溫的選擇 分別比較考察了20、25、30℃柱溫對柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷出峰時間及峰形的影響，結果表明25℃柱溫下效果最好，故選擇25℃作為柱溫。

3．5 色譜柱的選擇 本實驗分別考察了3種色譜柱 Cosmosil－C18(5 μm，4．6 mm ×250 mm)、Phenomenex－C18(5 μm，4．6 mm ×250 mm)、Welchrom－C18(5μm，4．6 mm ×250 mm)對樣品中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的分離效果，結果Welchrom－C18色譜柱分離度較差，Cosmosil－C18和Phenomenex－C18色譜柱的分離效果、峰形均良好，但Cosmosil－C18柱的出峰時間較早，故選擇Cosmosil－C18柱作為本實驗的色譜柱。

4 結論

本實驗建立的HPLC法同時測定痛經貼劑中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量方法，具有操作方便、準確可靠及重復性和穩定性好的優點，可作為痛經貼劑的質量控制方法。

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