靶向遞藥系統長循環脂質體的研究進展

胡曉靜，蘇 峰，何廣衛

(1.安徽中醫藥大學，安徽合肥 230012;2.合肥醫工醫藥有限公司，安徽合肥 230088)

目前癌癥仍是一類死亡率高且無法治愈的疾病［1］。現如今藥物的保守治療仍占重要地位，但普通劑型的抗腫瘤藥物因靶向性差，體內呈全身性分布而引發一系列不良反應，導致化療失敗。近年來臨床上已有一些抗腫瘤靶向制劑的新劑型，能實現抗癌藥物的定位釋放、減少毒副作用、提高抗癌效果，如脂質體、白蛋白納米粒、微乳等［2］。盡管這些新技術的出現取得了一定的療效，但仍存在一些局限:白蛋白納米粒中人血清來源有限、牛血清會產生輕度免疫反應;微乳中的表面活性劑和助表面活性劑具有潛在胃腸道刺激性和全身慢性毒性傾向。故此，更多的研究者將目光投向了脂質體，以期實現更好的治療效果。

脂質體的出現已經有50余年的歷史，其粒徑在25～2 500 nm之間［3］，處于納米級別的脂質體，因其具有粒徑小、比表面積大的性質，使得脂質體負載更多的藥物透過血液屏障到達靶器官成為可能。但是普通脂質體存在以下問題:貯存過程中易發生氧化、分層、泄漏等穩定性大大降低的現象;進入血液循環后易被網狀內皮細胞吞噬。而長循環脂質體因能夠避免網狀內皮系統的快速吞噬、阻斷腫瘤組織血管新生、增強在腫瘤組織中的滲透與滯留、與腫瘤細胞特異性結合等而發揮較好的抗腫瘤作用，造福人類。本文對長循環脂質體及其制備方法、質量評價、藥動學及藥效學等進行綜述如下。

1 長循環脂質體概念

長循環脂質體是指脂質體經表面修飾，達到定位、濃集、緩釋、保護、體內可生物降解的一類脂質體。目前長循環脂質體的修飾物有:神經節苷脂GM1、非離子表面活性劑、聚乙二醇(PEG)及其類脂衍生物等。其中PEG及其類脂衍生物因來源廣泛且無免疫毒性等，成為目前常用的長循環表面修飾物，主要包括 PEG-DSPC、PEG-PE、PEG-DSPE、PEGPC等。修飾后的脂質體可因PEG分子中大量的親水基團與水結合構成空間位阻，降低網狀內皮系統(RES)的識別和吞噬概率，使有效的血藥濃度長時間作用于靶組織或靶細胞中，提高治療效果［4］。

2 長循環脂質體的制備工藝

長循環脂質體的制備方法包括薄膜分散法、逆向蒸發法、乙醇注入法等。

2.1 薄膜分散法 薄膜分散法是指將膜材溶于適量有機溶劑并經減壓旋轉，有機溶劑揮發完全后加入含藥緩沖溶液，水化成均勻脂質膜，經探頭超聲，過膜整粒，得長循環脂質體混懸液，充入N2，4℃密封保存。對于脂溶性藥物多選此法。但是選用薄膜分散法制備的脂質體粒徑一般較大(＞1μm)，若結合高壓均質法，能很好地降低脂質體粒徑。現引申的方法包括薄膜分散—高壓勻質法、薄膜分散—硫酸胺梯度法等。

陳宇潮等［5］采用薄膜分散—高壓均質法制備多烯紫杉醇長循環脂質體(DPL)，通過單因素實驗證實了當均質壓力為50 MP，均質次數為3次時，所制備的DPL粒徑較小且分布均勻、包封率較高。劉艷芳等［6］以薄膜分散法結合硫酸銨梯度法制備了含表阿霉素和白藜蘆醇的復方長循環脂質體(PEGEPI-RES-L)，其外觀呈淡藍色乳光。丁達爾現象明顯。與普通脂質體相比，兩種藥物的包封率和穩定性均明顯提高。體外釋放度實驗顯示PEG-EPIRES-L較其普通脂質體(EPI-RES-L)和原料藥(EPI+RES)釋藥速度明顯緩慢。體外細胞毒試驗證明，PEG-EPI-RES-L組平均細胞存活率遠低于EPI-RESL組和EPI+RES組，表現出了較強的抗腫瘤活性。

2.2 乙醇注入法 乙醇注入法系將成膜材料與PEG、難溶性藥物溶于乙醇溶液中，作為有機相，將磷酸鹽緩沖液作水相。在水浴、攪拌的條件下，將有機相勻速注入緩沖溶劑中，揮去有機溶劑至無醇味，靜置，過一定大小的微孔濾膜。4℃冰箱保存。該法工藝簡單、重復性好且有機溶劑的使用量少，較為常用。

尤佳等［7］利用乙醇注入法制備了姜黃素長循環脂質體(Cur-LCL)，其粒徑分布均勻、粒子間無黏連、聚集現象。對其穩定性進行考察發現，在4℃密封放置3個月后，包封率無顯著變化、穩定性較好。同時體外模擬釋藥結果表明Cur-LCL藥物持續穩定釋放達24 h以上，表明Cur-LCL具有長循環作用。

2.3 逆向蒸發法 逆向蒸發法是將含藥的水溶液加入到含有磷脂等膜材、修飾物的有機溶劑中后，探頭超聲成乳液，經減壓蒸發除去有機溶劑，所得混懸液擠壓過膜。4℃冰箱保存，即可。此法所得的長循環脂質體大小均勻，對水溶性藥物包封率較高［8］。

Cheraga Nihad等［9］采用逆向蒸發法制備了Mpeg2000-DSPE修飾的奧沙利鉑長循環脂質體，并分別通過0.8、0.45 和 0.22 μm 聚碳酸酯濾膜，所得脂質體在透射電子顯微鏡下呈球形結構、大小均勻、粒度分布較小、平均粒徑約為204 nm，同時體外模擬釋藥擬合呈一級模型。王翠艷等［10］采用逆向蒸發法制備的米托蒽醌長循環脂質體，其粒徑范圍在83～199 nm之間。荷瘤鼠體內藥物分布顯示，米托蒽醌長循環脂質體體內循環時間高于普通脂質體，肝、肺分布率也高于普通脂質體，為米托蒽醌長循環脂質體的臨床抗癌研究提供依據。

3 長循環脂質體的質量評價

3.1 長循環脂質體的外觀及表面形態 觀察理想的長循環脂質體外觀應具備以下特征:粒徑分布均勻、顆粒間分散較好、連續呈圓形或橢圓形等。這樣可使藥物易于濃集于靶部位，提高治療指數。形態觀察可先采用磷鎢酸染色液進行負染后，透射電子顯微鏡測定。粒徑及粒度分布采用激光散射粒度分析儀進行測定。由于制備方法不同，所得的粒徑也有所差異。

方瑜等［11］以制備的粒徑為20 nm的Fe3O4為磁性材料，聚乙二醇單甲醚(mPEG)為修飾劑制備了鹽酸表柔比星長循環磁性脂質體。2%磷鎢酸負染，透射電鏡觀察表面近球形，平均粒徑為50 nm，包封率達57.5%。謝向陽等［12］以pH梯度法研制了重酒石酸長春瑞濱長循環脂質體，采用Mas-tersizer2000粒度分析儀測得平均粒徑為(96.4±27.2)nm。透射電鏡觀察顯示，粒子大小分布均勻、無聚集現象。

3.2 長循環脂質體的載藥量和包封率 優良的長循環脂質體應當具備良好的載藥能力、藥物包封能力及穩定性。通常認為，載藥量越高越好。同時也要結合藥物在血中的穩定性來確定適當的載藥量，使藥效發揮最好。但由于脂質體易出現滲漏現象，因此，在脂質體的研究中包封率是質量控制的重要指標之一。影響藥物的包封率大小的因素主要包括長循環脂質體制備過程中的處方因素及工藝因素。吳燕等［13］證明了當選擇磷脂濃度為75 g·L－1、藥脂比為1∶30時，表柔比星長循環熱敏脂質體包封率較高。有文獻報道當增加均質壓力時，多紫杉醇長循環脂質體粒徑減少，包封率下降［5］。對于長循環脂質體包封率的測定，通常采用一定的方法，如凝膠柱色譜法、超濾法、魚精蛋白沉淀法、有機溶劑法、萃取法、透析法等將長循環脂質體中包封藥物與游離藥物分開，再以適當的方法直接或間接的測定。

陳道陽等［14］采用葡聚糖凝膠－G50微型柱法分離川芎嗪長循環脂質體和游離藥物，并以高效液相色譜法直接測定川芎嗪長循環脂質體的包封率。結果當采用色譜柱徑高比為15 cm∶0.8 cm、洗脫液流速為 0.5 mL·min－1、上樣量為0.25 mL 時，川芎嗪長循環脂質體先被洗脫，且與未包封游離藥物被洗脫間隔有3 mL的洗脫量，表明了葡聚糖凝膠－G50微型柱能夠將川芎嗪長循環脂質體和游離藥物完全分離。同時計算出的川芎嗪長循環脂質體平均包封率為81.45%。趙利剛等［15］采用超濾法將酒石酸長春瑞濱(VBT)長循環脂質體混懸液置超濾管中離心60 min，HPLC法測得VBT長循環脂質體的包封率，同時考察了離心時間、膜截留相對分子質量、脂質濃度對包封率測定的影響。喻樊［16］報道了以魚精蛋白沉淀法間接地測定絞股藍總皂苷長循環脂質體的包封率為74.4%。同時許磊磊等［17］證實了不同處方工藝所得的包封率也不同。

3.3 長循環脂質體穩定性 研究納米粒的穩定性是影響藥效的重要原因。長循環脂質體混懸液在貯存期間會發生穩定性降低現象如絮凝、藥物滲漏等。因此對脂質體的穩定性進行研究有著十分重要的意義。長循環脂質體穩定性考察指標有很多，如外觀、粒徑、表面電位、含量、磷脂的氧化指數等。同時在體內血液中的多種成分均可不同程度地破壞長循環脂質體，造成藥物滲漏。如:高密度脂蛋白、血清白蛋白、血液中的磷脂酶等。因此，有必要對長循環脂質體滲漏率進行測定。

牛鳳菊等［18］采用高效液相法分別對置冰箱(4℃)和室溫(25℃)保存下的含長春堿的長循環陽離子脂質體進行滲漏率的測定。結果表明，脂質體在25℃保存60 d時的滲漏率明顯高于4℃條件的情況。說明了存溫度會影響脂質體的滲漏率。此外，李偉超［19］通過光照、溫度及加速實驗考察了β-欖香烯長循環脂質體的穩定性，證實了欖香烯長循環脂質體需低溫避光保存，以防止藥物滲漏。

4 長循環脂質體藥物動力學、藥效學研究

長循環脂質體是一種基于納米級的給藥靶向制劑，載藥納米粒可以從腫瘤間隙的內皮組血管中逸出而進入腫瘤發揮療效，改變了藥物的體內組織分布和體內代謝行為。對抗腫瘤藥物在動物體內的藥物動力學及藥效學研究，可為臨床研究提供有力的理論意義。

時軍等［20］采用卵磷脂、膽固醇、PEG2000-DSPE摩爾比為10∶5∶0.3制備足葉乙苷長循環脂質體。小鼠體內藥代動力學顯示，長循環脂質體的消除半衰期和藥時曲線下面積(AUC)分別是注射劑的17倍和3.5倍。馮麗萍等［21］比較了川芎嗪的長循環脂質體和普通脂質體在SD大鼠體內的藥代動力學發現，川芎嗪的長循環脂質體的消除半衰期約是普通脂質體的10倍，AUC大約是普通脂質體的4倍。周蔚等［22］通過對荷瘤裸鼠尾靜脈注射紫杉醇注射液、空間穩定性紫杉醇脂質體(SSL-PTX)、主動靶向肺癌的空間穩定性紫杉醇脂質體(T-SSL-PTX)，考察各劑型中紫杉醇藥代謝動力學行為。結果6 h后紫杉醇注射液組幾乎檢測不到有效藥物濃度，而SSL-PTX及T-SSL-PTX組在9 h后仍測出較高濃度。表明了長循環脂質體能夠延長藥物在體內循環時間，便于藥物從血液循環分布到靶部位。

奧沙利鉑臨床上常用于治療多種癌癥的鉑類抗癌藥物，白細胞減少是其常見的不良反應。李哲等［23］采用乙醇注入法研制了載有奧沙利鉑的長循環脂質體(OLCL)，并考察其在S180荷瘤小鼠體內的藥效學，發現與生理鹽水組相比，奧沙利鉑溶液組的白細胞計數、脾臟指數和胸腺指數明顯降低，而OLCL組無明顯變化;但奧沙利鉑長循環脂質體的抑瘤率為 85.8%，遠遠高于奧沙利鉑溶液組30.4%。表明了長循環脂質體能夠減少對白細胞的殺傷、降低免疫系統的毒性。Pi等［24］以等劑量小鼠靜脈注射丹酚酸B注射液、丹酚酸B普通脂質體和丹酚酸B長循環脂質體，并以超高效液相色譜串聯質譜法(ULPC-MS/MS)測定各組織中的濃度。組織實驗表明，在注射240 min后仍能在肝、脾、肺等組織中測到丹酚酸B長循環脂質體的有效的血藥濃度。Shavi等［25］采用薄膜分散法制備了阿那曲唑普通脂質體和經PGE修飾的阿那曲唑長循環脂質體，Wistar大鼠體內實驗結果表明，阿那曲唑長循環脂質體和普通脂質體的AUC分別是阿那曲唑原料藥的3.33和20.28倍，表明了阿那曲唑長循環脂質體能夠發揮長循環及緩釋性，在乳腺癌的治療中具有明顯優勢。

在長循環脂質體表面連接一些能夠特異性或非特異性結合靶細胞的分子，它們能夠與靶部位相結合，發揮良好療效。馬哲松［26］通過體外細胞攝取實驗和細胞毒性實驗發現，精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(RGD)修飾紫杉醇長循環脂質體(PTX-RGDLPs)組的腫瘤細胞定向攝取率高于普通脂質體的3.1倍，細胞毒性高于紫杉醇溶液組和普通紫杉醇脂質體組，說明了經 RGD修飾可顯著富集靶向于腫瘤組織，提高藥物療效。江峰等［27］以曲妥珠單抗(TMAB)修飾得阿霉素免疫脂質體(DOX-IML)，體外釋放實驗研究表明，DOX-IML在12 h內藥物累積釋放量達40%，72 h達釋放平衡。表明DOX-IML具有一定的緩釋性。細胞毒性實驗顯示:阿霉素免疫脂質體的細胞毒性大于阿霉素脂質體。表明TMAB能夠提高阿霉素脂質體的主動靶向性，提高了阿霉素的抗腫瘤活性，減少了對其它正常細胞的毒副作用。

5 長循循環脂質體的展望

近年來，依賴納米給藥系統的腫瘤治療越來越受到關注，將納米技術應用于腫瘤早期的預防、診斷、以及綜合治療等方面，已成為國際上重要的新興學科方向［28］。長循環脂質體因具有體內長循環、靶向、保護、高效低毒等特性，極大地解決了脂質體作為納米給藥載體的不足而倍受青睞。如它可作化療藥物的載體(如紫杉醇、多柔比星、順鉑等);可作基因治療的非生物載體;可長時間富集于病灶，支持某些慢性疾病的治療。此外，經PEG修飾的長循環脂質體，能夠接入抗體、多肽、多糖、葉酸而增加與腫瘤表面的親和力，也有研究報道過以腫瘤細胞內的線粒體為靶點來誘導細胞凋亡［29］。

盡管如此，隨著研究的深入，近年來發現PEG化脂質體也存在相應的負面影響，也就是所謂的PEG“窘境”(PEG dilemma)，如皮下或靜脈注射PEG化脂質體引起的加速血液清除(Accelerated blood clearance，ABC)現象［30－31］、妨礙 pH 敏感脂質體細胞內的“核內體逃逸”現象等［32］。雖然動物體內藥效學及藥動學研究證實長循環脂質體具有長循環、緩釋、靶向等效果，但實驗室動物模型的藥動學的研究對象并不能完全代表人體的臨床實際應用。目前，長循環脂質體的研究主要集中于實驗室的摸索，上市的藥物并不多。因此，對于制備出收率更高，質量穩定性更好，所需生產成本更低的長循環脂質體，還需要后續更多藥學工作人員的不斷努力。

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