胸膜肺炎放線桿菌Δlip40回復突變株的構建及鑒定

胡雪鶴， 劉彩紅， 閻 浩， 祁 超

(華中師范大學 生命科學學院， 湖北省遺傳與調控重點實驗室， 武漢 430079)

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胸膜肺炎放線桿菌Δlip40回復突變株的構建及鑒定

胡雪鶴*， 劉彩紅*， 閻 浩， 祁 超**

(華中師范大學 生命科學學院， 湖北省遺傳與調控重點實驗室， 武漢 430079)

胸膜肺炎放線桿菌(APP)可引起豬胸膜肺炎，在一定程度上阻礙了養豬業的發展.目前，APP基因組中已得到有效鑒定的基因不足10%.為建立有效的APP功能基因研究體系，本文以前期構建的血清1型APP SLW01株外膜脂蛋白基因缺失突變株Δlip40為親本，通過電轉化法將攜帶有完整lip40基因的穿梭質粒pJFF-lip40導入Δlip40中，通過氯霉素抗性篩選獲得回復突變株CΔlip40.對CΔlip40的生物學特性進行了初步分析發現，穿梭質粒可在APP中穩定遺傳，并且APP生長能力未受穿梭質粒轉入的影響.此外，SLW01和Δlip40對氯霉素高度敏感，但回復突變株CΔlip40較前兩種菌株對氯霉素抗性明顯增強，表明穿梭質粒pJFF224-XN抗性基因可在APP菌株中穩定表達.回復突變株CΔlip40的成功構建為分析脂蛋白Lip40致病機制提供了有效對照材料，本研究中建立的互補菌株構建系統以及APP抗性評價方法將有助于今后深入研究APP生物學特性及基因功能.

胸膜肺炎放線桿菌； 回復突變株； 構建； 鑒定

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是一種革蘭氏陰性小球桿菌.該菌血清型較多，基于莢膜多糖抗原性，目前可將該菌劃分為15個血清型[1].此外，還可以根據對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的依賴性分為非NAD-依賴的生物II型(血清型13、14)，和NAD-依賴的生物I型(血清型1-12、15)，所有血清型菌株都與豬致病相關.APP 可引起豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，是一種接觸傳染性呼吸道疾病，通常表現為急性出血性、纖維素性、壞死性支氣管肺炎和纖維素性胸膜炎，感染該菌后，各年齡階段的豬都可能發病，該病給多個國家和地區的養豬業都曾造成較大的經濟損失[2].該病于1957年由Pattison等[3]首次報道后，在世界范圍內爆發和流行.研究表明，APP是一種多毒力因子病原菌，現已證明細菌毒素、莢膜多糖、脂多糖、粘附因子、蛋白酶、外膜蛋白以及轉錄調控因子等多種因子與該菌致病相關[4-7].

細菌脂蛋白(Lipoprotein，Lpp)是一類重要的功能蛋白，具有多種生理作用，如參與生物合成、維持細胞結構、物質轉運等[8].Lpp在病原菌致病過程中起重要作用，除可作為黏附分子和增加病原抗逆性外，還能調節宿主免疫應答反應.另外，一些病原菌Lpp具有較好的免疫原性，是亞單位疫苗開發的靶標[9].目前，人們對于多種常見人類疾病致病菌Lpp的生物學特性有了較多認識，但對動物病原菌APP Lpp的研究則相對較少.且之前對于APP Lpp的研究多側重于免疫原性及疫苗應用研究，人們已經克隆到一些具有良好免疫原性的脂蛋白，如TbpB[10]和多種OmlA[11-12]，證實具有疫苗應用潛力，并成功開發為疫苗(PleuroStar APP， Novartis Animal Health Inc.， Switzerland).

通過生物信息學方法篩選到一個外膜脂蛋白基因lip40，隨后通過同源重組和負向篩選法成功構建lip40基因缺失突變株Δlip40.本研究以Δlip40為親本菌株，通過電轉化的方法將攜帶有完整lip40基因的E.coli-APP穿梭質粒導入lip40基因缺失突變株Δlip40中，構建回復突變株CΔlip40，并分析了該菌遺傳穩定性、生長能力以及氯霉素抗性，為進一步分析Lip40的生物學功能奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 主要試劑

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)購自美國Sigma公司.各種限制性內切酶、LATaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker及pMD18-T載體購自大連寶生物工程(大連)有限公司.DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司.胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白大豆肉湯(Tryptic soy broth，TSB)購自美國Difco公司.

1.2 菌株、質粒以及引物

血清1型胸膜肺炎放線桿菌SLW01為華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室貝為成教授惠贈.胸膜肺炎放線桿菌lip40基因缺失突變株Δlip40由本實驗室構建并保存.大腸桿菌EscherichiacoliDH5α由本實驗室保存.穿梭質粒pJFF224-XN[13]由瑞士伯尼爾大學Joachim Frey教授惠贈.

擴增lip40基因所用引物：

P1：5′-GGCTGCAGATGAAAAACATCACAAAATTTG-3′，含PstI酶切位點(見下劃線)；

P2：5′-TTGCGGCCGCTTACTTTTGTTGTTTTGCGC-3′，含NotI酶切位點(見下劃線).

APP菌株鑒定所用引物(tonB2基因)：

P3：5′-TTGGATCCGATGATTTACCCCAAGAAG-3′；

P4：5′-TTAAGCTTACCACTACCGCCTACCGC-3′.

穿梭質粒pJFF224-XN鑒定引物為：

P5：5′-GAATTTTACCCGGATTGACC-3′；

P6：5′-GCTGAAACTTTGCCATCGTA-3′.

1.3 APP基因組提取以及lip40基因擴增

取血清1型APP分離株SLW01的新鮮培養物，根據文獻[14]描述的方法提取APP基因組.以基因組為模板，通過引物P1和P2擴增lip40基因.擴增條件為：94℃ 10 min；94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 2 min，共30個循環；然后72℃延伸10 min.

1.4 穿梭質粒的構建

將前述PCR產物lip40基因連接到pMD18-T載體，得到質粒pMD-lip40，經酶切鑒定正確后，以PstI/NotI雙酶切，回收lip40片段并連接到經同樣酶切的穿梭質粒pJFF224-XN中，得到攜帶外源基因的穿梭質粒pJFF-lip40.

1.5 電轉化以及回復突變株的抗性篩選

大量制備質粒pJFF-lip40，用電轉化將重組穿梭質粒pJFF-lip40轉入基因缺失突變株Δlip40.APP電轉化感受態細胞的制備參考文獻[15]進行.電轉化參數：電壓2.5 kV，電容25 μFD，脈沖電阻800 Ω.電擊后將菌液置37℃恢復培養3 h后涂布抗性平板.氯霉素抗性篩選陽性克隆時，分別設置氯霉素濃度為2.5 μg/mL，2 μg/mL，1.5 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL.篩選具有氯霉素抗性的克隆，再用PCR加以驗證.將得到的突變株命名為CΔlip40.

1.6 CΔlip40的遺傳穩定性分析

將得到的回復突變株CΔlip40在不含氯霉素抗性的TSA培養基上傳代10次，之后涂布到不含氯霉素的TSA平板，隨機挑選10個單克隆，接種于無氯霉素的TSB培養基，經過夜培養后，用PCR鑒定，以確定CΔlip40是否發生回復.

1.7 CΔlip40的生長能力分析

將過夜培養的SLW01、Δlip40、CΔlip40分別以1∶100的比例接種到100 mL TSB培養基中(含NAD和10%小牛血清)，接種后每隔1 h取樣一次，測定菌液在600 nm下的吸光值(OD600)，共測10 h，重復3次取平均值.比較3種菌株的生長能力.

1.8 CΔlip40的氯霉素抗性分析

為了檢測SLW01、Δlip40、CΔlip40 3種菌株的氯霉素敏感性，取96孔細胞培養板，在第一列加入150 μL含NAD和10%小牛血清的TSB培養基，并將第一列氯霉素濃度設置為20 μg/mL，其后每孔加入75 μL培養基，從第一列培養基中取75 μL到第二列并進行混勻，依次類推，將氯霉素依次進行2倍稀釋.將過夜培養的SLW01、Δlip40、CΔlip40分別以1∶100的比例接種到TSB培養基中(含NAD和10%小牛血清)，待細菌生長至OD600值為0.4～0.5時，用培養基(含NAD和10%小牛血清)進行50倍稀釋，接種于96孔細胞培養板，每孔加入75 μL稀釋后的菌液于37℃搖床緩慢振蕩培養.每隔1 h測定一次OD600值，共測7 h，重復3次取平均值.比較3種菌株對氯霉素的敏感性.

2 結果與分析

2.1 穿梭質粒pJFF-lip40的構建

以提取的APP基因組DNA為模板，以P1/P2為引物進行PCR擴增，得到的產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1A所示，PCR產物大小約為900 bp，與預期大小相符(連同引物實際長度為927 bp).將PCR擴增的lip40基因克隆到pMD18-T載體中，序列分析證實無堿基誤配.將擴增片段經PstI和NotI酶切并插入到穿梭質粒pJFF224-XN的T4啟動子下游.構建的重組質粒命名為pJFF-lip40.經PstI和NotI雙酶切后得到2條帶，大小約為8 000 bp和900 bp，表明質粒構建正確(圖1B).

(A) M：DNA marker;1：空白對照;2、3：lip40基因的PCR擴增產物;(B) M：DNA marker;1：重組質粒pJFF-lip40雙酶切(Pst I/Not I)產物.

2.2 回復突變株的篩選與初步鑒定

將穿梭質粒pJFF-lip40以電轉化的方法導入血清1型lip40基因缺失突變株Δlip40中，當氯霉素濃度為1 μg/mL時，有菌落生長，隨機挑取克隆轉接至含氯霉素的TSB培養基，均可培養至渾濁，取培養物進行PCR驗證，分別用3對引物加以驗證：引物P1和P2用于擴增lip40基因；引物P3和P4用于擴增APP基因組中tonB2基因；引物P5和P6用于鑒定穿梭質粒.PCR結果(圖2)均與預期相符，表明篩選的回復突變株初步證實是正確的.本次測試中隨機挑選的克隆均為陽性，表明本實驗體系能高效獲得APP回復突變株.

M:DNA marker.1～4：引物P3/P4驗證結果.5：陽性對照.6：空白對照.7～10：引物P5/P6驗證結果.11：陽性對照.12：空白對照.13～16：引物P1/P2驗證結果.17：陽性對照.18：空白對照.

2.3 CΔlip40的遺傳穩定性

CΔlip40在不含氯霉素的TSA培養基上連續傳代10次后，分別以引物P1/P2、P3/P4、P5/P6進行PCR擴增，均能擴增出特異性片段(圖3)，表明穿梭質粒pJFF-lip40在APP菌株CΔlip40中穩定存在，不需要額外添加氯霉素抗性選擇壓力.

(A) M:DNA marker;1：空白對照;2：陽性對照;3～12：引物P3/P4驗證CΔlip40 1～10代遺傳穩定性結果;(B) M:DNA marker;1～10：引物P5/P6驗證CΔlip40 1～10代遺傳穩定性結果;11：陽性對照;12：空白對照;(C) M:DNA marker;1：空白對照;2：陽性對照;3～12：引物P1/P2驗證CΔlip40 1～10代遺傳穩定性結果.

2.4 CΔlip40體外生長能力分析

APP野生型菌株SLW01、lip40基因缺失株Δlip40以及回復突變株CΔlip40的生長曲線如圖4所示.可見回復突變株和親本菌株以及野生型菌株生長能力差別不大，表明攜帶穿梭質粒并沒有明顯影響APP的生長速度.

圖4 SLW01、Δlip40以及CΔlip40體外生長能力分析Fig.4 Growth ability of SLW01， Δlip40 and CΔlip40 in vitro

2.5 CΔlip40氯霉素抗性分析

SLW01、Δlip40以及CΔlip40在不同氯霉素濃度下的生長曲線如圖5所示.當氯霉素濃度≤0.31 μg/mL時，SLW01菌株與Δlip40菌株可以生長，但在氯霉素濃度為1.24 μg/mL時，僅回復突變株CΔlip40可以生長，可以判定穿梭質粒CAT表達盒在CΔlip40中有效表達.同時也說明在回復突變株CΔlip40抗性篩選過程中，當所選擇的氯霉素抗性濃度為1 μg/mL時，能夠高效獲得CΔlip40陽性克隆，濃度過高(≥ 2 μg/mL)，無克隆生長；而0.5 μg/mL則有較多假陽性克隆.

(A) SLW01在不同氯霉素濃度下的生長曲線;(B) Δlip40在不同氯霉素濃度下的生長曲線;(C) CΔlip40在不同氯霉素濃度下的生長曲線.

綜上所述，本研究以缺失外膜脂蛋白基因lip40的缺失突變株為親本菌株，成功將攜帶有完整lip40基因的穿梭質粒pJFF224-XN導入lip40基因缺失突變株中，構建得到回復突變株CΔlip40.并且通過抗性篩選、遺傳穩定性分析、生長能力分析以及氯霉素抗性分析等一系列實驗對該回復突變株CΔlip40的生物學特性進行了初步分析.

3 討論

電轉化法是細菌、真菌等微生物導入外源基因的常用方法之一，尤其是采用化學或自然轉化法等傳統轉化方法遇到困難時應當首選電轉化法[16].其原理是利用瞬間高壓電脈沖，使細胞的表面產生膜暫時性的孔道，同時由于電擊作用可促進細胞膜融合，最后在細胞膜上產生大的孔道，易于質粒DNA進入[17].

基因敲除是研究細菌基因生物學功能及致病機理的重要方法，但在病原微生物的基因功能研究中，僅通過基因突變株表型變化還不夠，因為目的基因下游基因的轉錄起始位點可能存在于上游目的基因中，目的基因缺失后可能產生極性效應，導致其下游相鄰特別是相近基因轉錄水平改變，因而突變株的表型變化就不止是單個基因敲除所產生，而是由幾個相鄰基因共同變化所致.因此，通過構建回復突變株，分析基因互補后的表型或基因功能是否恢復，可以有效驗證目的基因的功能[18-19].

回復突變株常用的構建方法包括質粒法[20]以及基因原位整合法，質粒法相較于原位整合法操作更加簡單、快捷，并且原位整合法一般適用于質粒在宿主菌株中不能穩定存在或者不能有效表達時[21-22].用于構建回復突變株的穿梭質粒pJFF224-XN最初由Frey構建[13]，該質粒以廣宿主性質粒RSF1010為基礎而構建[23-25]，部分研究表明該質粒能在APP中拷貝，并攜帶II型氯霉素乙酰轉移酶基因.雖然該基因在APP中表達效率遠不及大腸桿菌(≥ 25 μg/mL)，但由于氯霉素在獸用領域禁用已久，許多APP分離株對氯霉素十分敏感，因此，不難獲得轉化子.另外，pJFF224-XN質粒當中還包含有T4噬菌體基因32的啟動子區域以及轉錄終止信號，能驅動下游基因表達[13].David等研究表明pJFF224-XN質粒可以在APP中高效的表達ApxI以及ApxII，證實了質粒的啟動子活性[26].

本研究還通過測定生長曲線的方法，比較了不同基因型APP菌株氯霉素敏感性.將對數中期APP菌株接種于不同氯霉素濃度液體培養基中，測定不同時間點的吸光值.結果表明，pJFF-lip40的表達使SLW01菌株獲得了一定的氯霉素抗性(1.24 μg/mL)，比不含質粒菌株高4倍.當篩選濃度為1.0 μg/mL時，隨機挑選克隆均呈穩定氯霉素抗性；而當篩選濃度下降至0.5 μg/mL時，TSA平板上部分轉化子，經PCR鑒定為APP，但無穿梭質粒，為假陽性克隆，但這樣的克隆轉接至0.5 μg/mLTSB培養基后不能生長，此結果與通過生長曲線法所得APP抗性濃度(≤ 0.31 μg/mL)符合.以上結果表明，生長曲線法可用于初步分析APP抗生素抗性.

綜上所述，本實驗中構建的回復突變株CΔlip40可以作為lip40基因功能研究的有效對照，本研究中所使用的回復突變株構建方法以及抗生素抗性分析法為后期深入研究APP功能基因及致病機制奠定了基礎.

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Construction and identification of complementation strain ofActinobacilluspleuropneumoniaemutant Δlip40

HU Xuehe， LIU Caihong， YAN Hao， QI Chao

(Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology，College of Life Sciences， Central China Normal University， Wuhan 430079)

Actinobacilluspleuropneumoniaeis the etiological agent of porcine pleuropneumonia (PCP)， which is associated with significant economic losses in swine industry worldwide. At present， the gene identification rate of APP genome is lower than 10%. To establish an effective research method for APP functional gene， an outer membrane lipoproteinlip40 gene deletion mutant of APP SLW01 (serovar 1)， was used as parent strain， named Δlip40. A shuttle vector containing intactlip40 gene (pJFF-lip40) was introduced into Δlip40 by electroporation， and through chlorampenicol resistance selection， complementation strain CΔlip40 was constructed. The preliminary analysis of biological characteristics of CΔlip40 was done. we found The shuttle vector was stable in CΔlip40， and the growth ability of CΔlip40 was not affected by the shuttle vector. Moreover， SLW01 and Δlip40 were highly sensitive to chloramphenicol while CΔlip40 had a stronger chloramphenicol resistance than the former two， indicating the resistance gene in pJFF224-XN stably expressed in the APP. CΔlip40 provided effective material for the analysis of pathogenesis of lipoprotein Lip40. The construction method of complementary strain and APP resistance evaluation method will be helpful for further investigating the biological characteristics and gene function of APP．

Actinobacilluspleuropneumoniae; complementation strain; construct; identification

2015-01-30.

國家自然科學基金項目(20772040).

1000-1190(2015)04-0590-06

S852.61< class="emphasis_bold">文獻標識碼： A

A

*并列第一作者.** 通訊聯系人.E-mail：qichao@mail.ccnu.edu.cn.