PD-1/PD-L1負性協同刺激通路在乙型病毒性肝炎慢性化中的地位及進展

徐成潤 綜述，伍偉平 審校

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是不直接引起細胞破壞的嗜肝DNA病毒，HBV持續感染造成乙型肝炎的慢性化，其臨床轉歸是由病毒和宿主兩方面的因素決定，其中機體免疫功能異常是造成HBV慢性持續感染的原因之一。在急性自限性乙型肝炎患者體內存在多克隆、特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和I型輔助性T(Th1)細胞反應［1］，而慢性HBV感染者體內病毒特異性CTL和Th細胞存在數量和功能上的缺陷。導致機體在防御病毒感染與維持自身耐受之間失去平衡的疾病慢性化、免疫耐受、腫瘤發生的確切機制尚有許多不明之處，但病毒抗原的持續存在導致體內特異性效應T細胞功能缺損是一個重要原因，而T細胞的狀態與細胞程序性死亡因子－1/細胞程序性死亡因子配體(PD-1/PD-L1)刺激信號密切相關［2］。

1 PD-1及其配體PD-L1

1.1 結構和表達 PD-1(programmed cell death 1)，也稱CD279，屬于B7免疫球蛋白超家族成員，相對分子量為55 000，結構上與CTLA-4有23%的同一性，胞外區由一個IgV樣域組成，胞質區含有兩個酪氨酸信號基序，其一為免疫受體酪氨酸抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)，另一為免疫受體酪氨酸交換模體(immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM)。ITSM 募集磷酸酶SHP-1和SHP-2，使TCR或BCR傳遞的效應信號發生去磷酸化，同時PD-1信號降低CD28介導的信號，抑制Akt激酶磷酸化、糖代謝及Bcl-XL的表達。PD-1表達較為廣泛，可在活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞和骨髓細胞上表達;少量表達于NK-T細胞表面［3］。因此和CTLA-4相比，其表達范圍更廣，預示著其作用也更為廣泛。

PD-1已被證明有兩個配體，分別為PD-L1(又稱B7-H1)和PD-L2(又稱B7-DC)。1999年發現并證實的PD-L1屬B7超家族成員，人PD-L1基因定位于人9p24.2，可編碼290個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，其胞外段為IgV和IgC樣結構域。PD-L1的mRNA 主要為4.2 kb，此外還有 1.8 kb、3.7 kb 和7.2 kb這3種轉錄形式，但其編碼產物相同，且功能相似。PD-L1基因與B7-1、B7-2基因的二級結構和三級結構十分相似，因而表現出相似的生物學功能。PD-L1表達于DC、B細胞、T細胞及髓系細胞，當這些細胞激活時 PD-L1表達上調［4］。此外，與 B7-1、B7-2不同，PD-L1也表達于非造血細胞如血管內皮細胞，因此在非淋巴器官中也有表達，可表達于心臟、肺、胰腺、肝臟、肌肉和免疫豁免部位，如眼和胎盤［5-6］。由于PD-L1能在非淋巴組織中表達，因而推測PD-1/PD-L1信號途徑不僅在淋巴器官，而且在非淋巴器官都能調節免疫應答，預示PD-1/PD-L1信號可能在這些外周器官中通過調節自身反應性T細胞、B細胞來調節免疫應答。PD-L2和PD-L1有40%的序列相同。與PD-L1不同，PD-L2僅表達于已誘導激活的巨噬細胞和DC，初步研究顯示PD-L2與PD-1的親和力大于PD-L1的3～6倍，并有不同的結合、解離動力學［7］。因此，PD-L1可能是外周組織、器官中主要的調節配體，而PD-L2則是在淋巴器官的免疫調節中起主導作用。

1.2 生物學特性 組織上表達的PD-L1對保護外周組織不受自身免疫的攻擊至關重要。實質細胞表達PD-L1，通過PD-1/PD-L1通路維持耐受狀態，如阻斷該通路，則可使自身免疫性疾病加重或腫瘤發生［2，8］。研究表明，PD-1/PD-L1 信號途徑能有效抑制T細胞增殖和細胞因子的產生，且其結合力遠大于PD-1與CD28的結合力［9］。對自身免疫性糖尿病NOD小鼠模型，PD-1-/-NOD小鼠［10］和PD-L1-/-NOD小鼠［11］都表現為糖尿病快速進展。無論是胰腺β細胞還是血管內皮上表達的PD-L1對于NOD小鼠自身免疫性糖尿病的發生都有保護作用。還有研究表明，用抗PD-L1 mAb阻斷PD-1/PD-L1通路可以抑制調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)的功能［12］。將異源C57BL/6脾細胞過繼輸入NOD/SCID小鼠發生移植物抗宿主病(GvHD)是致命的，而Treg細胞對于GvHD的抑制作用在給予抗PD-L1 mAb后終止，說明阻斷PD-1/PD-L1通路可以終止Treg介導的免疫調節功能。亦有報道在慢性炎癥中，PD-L1可通過 STAT-5的磷酸化負性調控Treg［13］。

在抗微生物感染免疫中，PD-1/PD-L1通路也起到關鍵作用。可能絕大部分微生物通過利用PD-1/PD-L1通路降低被清除的免疫，引起慢性、持續性感染［2］。在慢性病毒感染時，病毒特異性CD8+T細胞的功能通常都會減弱［14］，這與急性感染或疫苗接種后產生強力的效應和記憶性CD8+T細胞不同。在慢性感染模型中，如靈長類SIV感染、小鼠LCMV感染或HBV、HCV、HIV等病毒感染，通常可以觀察到去功能化的病毒特異性CD8+T細胞持續存在，其代表一系列免疫缺陷［15］。隨病毒載量的升高，病毒特異性T細胞的功能受損更加嚴重，早期的去功能化主要表現在增殖和產生IL-2的能力的喪失，晚期則表現為產生效應性細胞因子和溶細胞的功能的喪失。研究表明慢性HIV感染、LCMV感染及HCV感染時外周血CD8+T細胞上PD-1高度表達［16-18］，病毒感染基礎上的腫瘤亦可促進Jurkat細胞的PD-1高表達［19］。慢性感染時PD-1上調，PD-1/PD-L1通路在這一感染過程中對調節T細胞缺損有重要作用。使用抗PD-1或抗PD-L1阻斷抗體，病毒特異性CD8+T細胞應明顯增強，表現為特異性CD8+T細胞數量顯著增加，分泌的細胞因子增多及細胞毒功能增強［19］，功能恢復的病毒特異性CD8+T細胞使病毒載量明顯下降，但不會促進特異性CD8+T細胞的溶解活性［19］。有研究表明阻斷PD-1/PD-L1通路可使T細胞增生、CD8+T細胞的功能改善，抗PD-L1還可以恢復CD4+T細胞對HIV抗原的增生應答［20-21］，抗PD-L1可促進HCV特異性CD8+T細胞的增生。這些研究表明PD-1/PD-L1通路可以在慢性HIV和HCV感染中阻止抗病毒T細胞應答，阻斷這一通路可能恢復失能的T細胞，成為抗病毒治療的新策略。

2 肝臟免疫

肝臟是重要的免疫調節器官，而肝臟調節免疫的結果往往導致免疫耐受，目前認為肝臟庫弗細胞、DC、肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)等非實質細胞是肝臟發揮免疫功能的細胞基礎。Iwai等［22］研究證實PD-L1是LSEC誘導免疫耐受的分子基礎之一，PD-L1在小鼠庫弗細胞、LSEC均可表達。構建活化PD-1小鼠T淋巴細胞與肝臟非實質細胞共同培養，結果其T淋巴細胞增殖活性較WT小鼠明顯增強，向WT小鼠T淋巴細胞培養液中加抗PD-L1，T淋巴細胞增殖反應也增強。靜脈注射重組表達lac-Z的腺病毒引起的肝炎中PD-1小鼠T淋巴細胞增殖明顯，而脾臟中T淋巴細胞增殖活性與WT小鼠T淋巴細胞無差異，肝臟病理上PD-1小鼠表現為嚴重但短暫的肝炎，同時伴大量肝細胞凋亡，WT小鼠肝臟病理改變較輕，但清除病毒的時間卻明顯延長。肝臟是活化T淋巴細胞特異性聚集部位，并在此誘導凋亡，因此T淋巴細胞的肝內清除也是肝臟誘導免疫耐受的原因之一，而PD-L1是決定T淋巴細胞在肝內聚集和清除的效應分子。Dong等［23］發現 PD-L1缺陷小鼠(KO)的 T淋巴細胞在淋巴器官發育正常，在肝內淋巴細胞數量則明顯增多，其中CD4+T淋巴細胞輕度增加，CD8+T淋巴細胞增多顯著。在刀豆蛋白A誘發的自身免疫性肝炎中，PD-L1缺陷的小鼠肝炎癥狀較WT小鼠明顯為重，且死亡率高，同時自然殺傷T淋巴細胞減少，肝內CD8+T淋巴細胞明顯增加，激活誘導的CD8+T淋巴細胞凋亡明顯減少。由此可以看出PD-L1參與了肝臟的免疫調節功能，是肝臟維持T淋巴細胞穩態，以及誘導耐受、抗病毒反應的分子基礎之一。

3 PD-1/PD-L1通路與慢性乙型肝炎

抗病毒治療是慢性乙型肝炎治療的一個重要手段，有效的T細胞免疫應答是清除病毒的關鍵，HBV慢性感染過程中，機體效應、記憶性T細胞的功能缺損及病毒免疫逃避機制導致感染的持續性［24］，其抗病毒療效明顯低于急性感染者。T細胞的有效激活需要雙信號，其中由APC表面分子與T細胞表面相應受體結合所提供的第二刺激信號是非抗原特異性的，且是T細胞抗原特異性激活所必需的，決定受抗原刺激的T細胞是活化為效應細胞，還是去功能化或凋亡。其正向刺激信號分子以CD28為代表，負向協同共刺激分子PD-1/PD-L1通路最新認為與慢性病毒感染關系最為密切。研究表明，慢性HBV感染時，外周血T細胞中的PD-1表達水平明顯升高，且與HBVDNA拷貝數呈正相關，CD8+T淋巴細胞的含量與HBVDNA拷貝數呈負相關，CD8+T淋巴細胞的增殖功能與PD-1表達水平呈負相關［25］，PD-L1在 PBMCs中的表達水平也較正常對照者顯著升高，阻斷PD-1/PD-L1通路后，HBV特異性CD8+T細胞的功能得到改善［26］。將HBV特異性CTL移植入HBV轉基因小鼠后，這些細胞迅速被誘導分泌IFN-γ，但其分泌功能很快就被抑制，并伴隨PD-1表達上調，利用mAb阻斷PD-L1后，肝內特異性CTL數量增加，分泌 IFN-γ的時間延長［27］。而對HBV急性感染的研究表明，感染清除的患者體內病毒特異性的CD8+記憶性T淋巴細胞PD-1和CD38的表達下調，開始表達CD127，同時血清轉氨酶濃度降低，病毒被機體清除。因此認為PD-1是調節抗HBV特異性T細胞免疫的關鍵分子。上述研究均從不同的角度反映PD-1/PD-L1通路與乙肝病毒感染后的細胞免疫功能密切相關，并導致病毒在體內持續存在。

4 結語

在有效的抗病毒免疫應答和自身免疫耐受所需的刺激和抑制信號之間，PD-1/PD-L1信號通路至關重要，已在體外細胞培養中強有力地證實，封閉PD-1/PD-L1通路能有效恢復抗原特異性CTL功能，清除感染病毒。當然，由于肝臟組織中的PD-1及其配體的表達情況尚未檢測，故目前尚無證據證明肝內相關細胞的PD-1、PD-L1表達情況及其所代表的臨床意義，目前只能通過分析HBV感染后抗原特異性T淋巴細胞的抑制分子PD-1表達水平及其對T細胞功能的免疫調節作用了解HBV感染慢性化的機制并預測病情的轉歸。研究如何通過阻斷PD-1/PD-L1抑制性信號途徑來實現增強抗病毒特異性T細胞的功能，對于治療慢性HBV感染和打破免疫耐受都有重要的意義。盡管該信號通路還有許多尚不明確的環節有待解決，隨著不斷深入研究，其與抗病毒免疫的關系逐步闡明，該信號很有可能成為慢性乙型肝炎抗病毒治療的主要靶位。

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