丹紅注射液對血管性癡呆大鼠認知障礙改善作用及其機制研究*

陜西省人民醫院神經內二科(西安 710068)

郭荷娜 王 倩 楊 謙

丹紅注射液對血管性癡呆大鼠認知障礙改善作用及其機制研究*

陜西省人民醫院神經內二科(西安 710068)

郭荷娜 王 倩 楊 謙

目的：觀察丹紅注射液對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的影響，并探討其作用機制。方法：將SD大鼠隨機分為假手術組、對照組和丹紅組，每組又分為6h、24h、72h、1w、1m (n= 6) 四個亞組。采用雙側頸總動脈永久性阻斷法( 2-VO) 建立VD 大鼠模型，暗回避反應法測定學習記憶能力；應用免疫組織化學法、原位末端標記法檢測大鼠海馬CA1區HIF-1α表達及凋亡細胞數的變化。結果：①2-VO術后72h凋亡細胞數最多，與對照組相比，丹紅組各時間點凋亡細胞數目顯著減少；②6h時丹紅組潛伏期與對照組比較無統計學意義，從24h開始丹紅組各時間點潛伏期顯著延長;③6h時丹紅組HIF-1α蛋白表達與對照組無明顯統計學差異，24h丹紅組表達明顯升高，而從72h之后HIF-1α蛋白表達顯著降低。結論：丹紅注射液對血管性癡呆大鼠學習記憶障礙具有改善作用，其機制可能與調節了HIF-1α蛋白表達，減少了海馬CA1區的細胞凋亡有關。

丹紅注射液由丹參、紅花提取而成，具有活血化瘀、通脈舒絡之功效。臨床試驗[1-2]證實其有改善血管性癡呆患者學習記憶功能的作用，但具體的作用機制目前尚不明確。本研究旨在探討丹紅注射液對血管性癡呆大鼠認知功能的影響，并通過研究其對海馬CA1區細胞凋亡及低氧誘導因子-1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)表達的影響來探討其機制。

材料與方法

1 實驗動物的選擇及模型的建立 參照劉梅[3]等被動避暗回避反射試驗測定大鼠學習記憶能力。對健康SD大鼠進行初篩，將實驗大鼠背對洞口放入明室，啟動計時器，90s內進入暗室的大鼠納入實驗。采用的雙側頸總動脈永久性阻斷法( 2-VO)制作血管性癡呆動物模型[4]。以20% 水合氯醛0.6mg/ kg 腹腔注射麻醉大鼠，取頸前正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈(CCA) ，以1號手術線雙重結扎，逐層縫合。

2 動物分組及處理 將納入實驗的雄性SD大鼠90只，體重200～250g，隨機分為三組，每組30只。

2.1 丹紅組：術前3 d 至術后1 周，每天給予丹紅注射液0.5ml/kg腹腔注射，手術當天于結扎前1h 給藥，建2-VO模型。

2.2 對照組：于相同的時間分別給予等量氯化鈉溶液腹腔注射，余條件同丹紅組。

2.3 假手術組：僅分離暴露雙側CCA 而不結扎，然后逐層縫合。每組再根據缺血時間隨機分為5個亞組( 每組6只):6h組(6h)、24h組(24h)、72h組(72h)、1周組(1w)及1月組(1m)。

3 學習記憶能力測定 術前3d及術后每天均對大鼠進行學習訓練，大鼠背對洞口放入明室，進入暗室后通電刺激2s，電刺激后5s取出大鼠，歸籠飼養。測定時再將大鼠背對洞口放入明室，同時開啟計時器，記錄大鼠第一次進入暗室時間，即潛伏期(STL)。術后6h、24h、72h、1周、1月各時間點的大鼠均于處死前再次行避暗回避反射試驗測定學習記憶成績。

4 標本制備和檢測方法 6h、24h、72h、1周、1月各時間點再次麻醉大鼠，開胸灌注，斷頭取腦，置于4%聚甲醛中12h，于視交叉前緣行2mm厚冠狀切片，依次脫水、透明、浸蠟及包埋，5μm厚連續切片，TUNEL染色、HIF-1α免疫組化染色。在40×10光鏡下每張切片隨機選擇5 個不同的視野，計數每個視野中1 mm×1 mm 面積中陽性細胞數，取其平均值。

5 統計學方法 應用SPSS 13. 0 統計學軟件，所有數據以均值±標準差表示，組間比較采用方差分析和t檢驗法，取P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組不同時間點海馬CA1區細胞凋亡情況 假手術組可見少量凋亡細胞。建模24h后對照組凋亡細胞數開始增加，72h凋亡陽性細胞數最多，之后減少。與對照組相比，丹紅組各時間點凋亡細胞數目均顯著減少 (P< 0. 01)；1月后丹紅組凋亡細胞數與假手術組比較，差異無統計學意義，見表1。

2 各組不同時間點學習記憶能力測試結果 與假手術組相比，對照組及丹紅組大鼠各時間點潛伏期均顯著縮短(P< 0.01) ，提示雙側頸總動脈永久阻斷后大鼠學習記憶能力明顯下降，造模成功；與對照組各時間點相比，6h時丹紅組潛伏期與對照組無明顯統計學差異(P>0.05)，從24h開始丹紅組各時間點潛伏期顯著延長(P< 0.05) ，見表2。

表1 各組不同時間點海馬CA1區凋亡細胞數目(/mm2)

注：與假手術組相應時間點相比，*P<0.01；與對照組相應時間點相比，△P< 0.01

表2 各組大鼠不同時間點潛伏期數值 (s)

注：與假手術組各時間點相比，*P<0.01；與對照組相比，△P< 0.05

3 各組不同時間點海馬CA1區HIF-1α蛋白的表達 與假手術組相比，對照組及丹紅組各時間點HIF-1α蛋白表達明顯增加(P< 0.01)；6h時丹紅組HIF-1α蛋白表達與對照組無明顯差異(P>0.05)，24h丹紅組表達明顯升高(P< 0.05)，而從72h開始HIF-1α蛋白表達顯著降低(P< 0.05)，提示丹紅注射液可增加早期(24h)海馬CA1區HIF-1α蛋白的表達，但從72h開始則開始下調這種表達，見表3。

表3 各組大鼠不同時間點海馬CA1區HIF-1α表達( /mm2)

注：與假手術組相應時間點相比，*P<0.01；與對照組相應時間點相比，△P< 0.05

討 論

丹紅注射液主要成分包括丹參酮、丹參酚酸、紅花黃色素等組成，具有活血化瘀，通脈舒絡的功效[5]。另外還具有以下功能[6-8]：①降低血粘度、抗血栓形成；②激活和恢復紅細胞變形能力，改善微循環、抗氧化損傷等作用；③上調BDNFmRNA表達，抑制血管內皮細胞因缺氧導致的細胞凋亡，修復和防治各種遲發性神經元損傷的作用，對腦組織有明顯的保護作用。

被動暗回避反射實驗中STL越短則學習記憶能力越差。實驗發現經學習訓練已達到對暗環境被動回避的各組大鼠，2-VO術后6h 后再次行暗回避實驗時，對照組及丹紅組大鼠STL明顯短于假手術組，提示雙側頸總動脈永久性阻斷可顯著影響大鼠的學習記憶能力。對照組大鼠隨術后時間延長，STL逐漸延長，提示未經治療血管性癡呆大鼠學習記憶能力仍隨時間延長而有所恢復，推測這可能與側枝循環逐漸形成及自身的其他代償機制有關。與對照組相比，6h時丹紅組STL有所延長，但無顯著性差異，從24h開始丹紅組大鼠STL 顯著延長。由此可見，丹紅注射液可明顯延長血管性癡呆大鼠的潛伏期，對學習記憶障礙具有明顯改善作用，這種作用從術后24h才開始凸顯。海馬是與學習記憶有關的重要腦部結構，丹紅組各時間點海馬CA1區凋亡細胞數目均較對照組顯著減少，由此我們推測，丹紅注射液對血管性癡呆大鼠學習記憶功能的改善可能與減少海馬CA1區細胞凋亡有關。

血管性癡呆的發病機制目前尚未完全闡明，可能的發病機制包括膽堿能神經通路受損、興奮性氨基酸毒性作用、氧自由基釋放、神經元凋亡[9]等。低氧誘導因子-1是一種DNA 結合性蛋白質因子，具有α和β亞基，其中α亞基是調節HIF-1 活性的功能亞單位。腦缺血時，組織局部產生一種轉錄因子HIF，HIF進入細胞核內，與染色體上缺氧反應元件(Hypoxia response element，HRE)結合，啟動包括EPO基因在內的一系列基因的轉錄，參與了缺血/缺氧后血管生成、血管重塑、能量代謝、血管舒縮反應、細胞凋亡與增殖、紅細胞生成等代償過程，發揮腦保護作用[10-12]。但是HIF持續增多則可使糖酵解加強，線粒體代謝減弱；紅細胞增多，血液增稠；血小板增多，血栓易形成等不利影響，加重機體的缺氧。從本實驗可看出，6h時丹紅組HIF-1α蛋白表達與對照組無明顯差異，24h時丹紅組表達明顯升高，而此后72h開始HIF-1α蛋白表達顯著降低，提示丹紅注射液可增加早期海馬CA1區HIF-1α蛋白的表達，但從72h開始則開始下調這種表達，由此我們推測丹紅注射液可能通過早期上調HIF-1α蛋白表達啟動腦缺血缺氧后的防御機制，而72h后則下調HIF-1α蛋白表達避免其過度表達所產生的不利影響，從而起到了腦保護作用。

綜上所述，丹紅注射液可能對血管性癡呆大鼠的學習記憶障礙具有改善作用，其機制可能與調節了HIF-1α蛋白表達，減少了海馬CA1區的細胞凋亡有關，但其是如何通過調節HIF-1α蛋白表達從而發揮這一作用的，仍需分子生物水平的進一步研究。本研究為傳統中醫藥丹紅注射液的在血管性癡呆治療中的應用奠定了一定的理論基礎。

[1] 金 杰，賈敬選，郭智寬. 丹紅注射液治療血管性癡呆的臨床研究及對B- Ap、Apo B的影響[J]. 中醫學報，2010，147(25): 271- 273.

[2] 劉 剛.丹紅注射液聯合尼莫地平治療血管性癡呆35例[J].中國藥業，2012，12(21)：105.

[3] 劉 梅，鄭素軍，董 蕾，等. 側腦室注入胃動素對大鼠攝食及學習記憶能力的影響[J ]. 西安交通大學學報，2011，32 (1): 43- 46.

[4] 孫石磊，馬光瑜，王魯華，等. 納洛酮對血管性癡呆大鼠血漿內皮素的影響[ J] . 陜西醫學雜志，2005，34(4): 390-392.

[5] 姜 源. 丹紅注射液治療不穩定型心絞痛38例[J]. 陜西中醫，2014,35(11)：1487-1488.

[6] 袁加文，王 楓，孫曉江. 丹紅注射液治療急性缺血性腦卒中的臨床研究[J]. 中國老年學雜志，2011，31(1)：41- 42.

[7] 趙培欣，江 珊. 丹紅注射液對PCI術后患者ET-1、sP-sel及hs- CRP的影響[J]. 中國中西醫結合雜志，2011，31(1)：11- 14.

[8] 王世彬，程麗平，李 沖，等. 丹紅注射液對缺血性腦卒中患者血脂水平、NFDS評分、Barthel指數的影響[J].陜西中醫，2015,36(4)：390-392.

[9] 黃 瑋. 血管性癡呆的發病機制研究進展[J].中國醫藥指南，2012，10(5): 62-64.

[10] Liu R，Suzuki A，Guo Z，etal. Intrinsic and extrinsic erythropoietin enhances neuroprotection against ischemia and reperfusion injury in vitro[J]. J Neurochem，2006，96 (4):1101-1110

[11] Lin Chen-Huan，Lee Hsu-Tung，Lee Shin-Da，etal. Role of HIF-1α-activated Epac1 on HSC-mediated neuroplasticity in stroke model[J]. Neurobiol Dis，2013，58:76-91.

[12] Sheldon R，Ann Lee，Christina L，etal. Hypoxic preconditioning protection is eliminated in HIF-1α knockout mice subjected to neonatal hypoxia-ischemia [J]. Pediatr Res，2014，76(1)：46-53.

(收稿：2015-07-20)

Protective effects and mechanism of Danhong injection on learning-memory disorder of vascular dementia rats The Second Department of Neurology，People's Hospital of Shaanxi Province

(Xi’an 710068)

Guo Hena Wang Qian Yang Qian

Objective: To observe the effect of Danhong Injection on learning-memory disorder of vascular dementia rats，and to explore its mechanism. Methods: Male SD rats were randomly divided into three groups: sham- operated group，control group and Danhong group. The vascular dementia model was created by a permanent bilateral common carotid arteries occlusion (2-VO) in Sprague-Daewley rats. Rats were evaluated on learning-memory ability by passive avoidance test. At corresponding time points at 6h，24h，72h，1w and 1m，the dynamic changes on the cell counts of HIF-1a and apoptosis in hippocampus CA1 were determined by immunohistochemical method and TUNEL respectively. Results: ①The apoptotic neurons were injured most severely at 72h in control group. While in the Danhong group，the number of neuronal apoptosis significantly decreased at respective time. ②Compared with the rats in control group，the performance on passive avoidance test of rats in Danhong group was improved significantly after 24h. There were no differences at 6h. ③The level of positive expression of HIF-1α in the hippocampal CA1 significantly increased at 24h，but significantly decreased after 72h. Conclusion: Danhong Injection could improve the learning-memory ability of vascular dementia rats. The protective mechanism might be related to the effect of preventing apoptosis in rat hippocampus CA1and regulating expression of HIF-1a.

@Danhong Injection Dementia，vascular/drug therapy Learning memory disorder Rats

*陜西省科學技術研究發展計劃項目-社發攻關(2014K11-02-04-14)

@丹紅注射液 癡呆，血管性/藥物療法 學習障礙 記憶障礙 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.004