共焦顯微鏡下不同程度干眼角膜內(nèi)樹突狀細胞觀察研究*

西安市第一醫(yī)院眼科(西安710002 )

朱海峰 程 燕 吳 潔 程 鈺 王雙勇

共焦顯微鏡下不同程度干眼角膜內(nèi)樹突狀細胞觀察研究*

西安市第一醫(yī)院眼科(西安710002 )

朱海峰 程 燕 吳 潔 程 鈺 王雙勇

目的：比較不同程度干眼患者共焦顯微鏡下角膜內(nèi)樹突狀細胞的密度、活化細胞比例，以期進一步揭示干眼的炎癥機制，為干眼的臨床診斷和治療提供依據(jù)。方法：選擇臨床診斷為輕度、中度及重度干眼患者各20例，對其雙眼進行共焦顯微鏡檢查，對每幅共焦圖片內(nèi)角膜上皮下的樹突狀細胞進行計數(shù)，并換算成細胞密度(個/ mm2)。比較不同程度干眼患者的樹突狀細胞密度的平均值。同時對不同程度干眼共焦顯微鏡下活化的樹突狀細胞比例進行統(tǒng)計比較。結(jié)果：輕度干眼上皮下樹突狀細胞密度為26.7±8.8個/mm2，其中活化細胞比率29.0±3.7%；中度干眼樹突狀細胞密度為69.6±11.1個/mm2，其中活化細胞比率83.5±7.6%；重度干眼樹突狀細胞密度為212.2±31.0個/mm2，其中活化細胞比率97.8±1.9%。干眼患者隨其嚴重程度增加，角膜上皮下樹突狀細胞密度亦呈增加趨勢，并且其上皮下活化的樹突狀細胞比例亦增加，具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：共焦顯微鏡下角膜內(nèi)樹突狀細胞是干眼炎癥的重要標志之一，其密度的變化和活化細胞的比例可作為評估干眼炎癥程度的有效指標。

2007年的國際干眼病專題研究報告會(DEWS)中提出干眼新的概念[1]。干眼病是淚液和眼球表面的多因素疾病，能引起不適、視覺障礙和淚膜不穩(wěn)定，可能損害眼球表面。干眼病伴有淚膜滲透壓增加和眼表炎癥。與傳統(tǒng)干眼定義相比較，上述概念強調(diào)了炎癥在干眼發(fā)病中的重要作用。Stern等[2]將主淚腺、角膜、結(jié)膜、副淚腺和瞼板腺以及淚腺之間的神經(jīng)支配統(tǒng)稱為淚腺功能單位(LFU)。眾多臨床研究和動物實驗提示，干眼是眼表慢性的自身免疫性疾病，淚液的高滲透壓觸發(fā)眼表的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致LFU失調(diào)是各型干眼發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。眼表組織中抗原提呈細胞(APC)包括單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等。眼表的干燥和淚液的高滲刺激角膜上皮細胞產(chǎn)生炎癥遞質(zhì)如IL-1β、IL-8、TNF-α及MMP等激活未成熟的角膜樹突狀細胞及新的樹突狀細胞進入角膜組織，進而上調(diào)趨化因子和MHCⅡ的表達，這些因子的表達進一步促進APC細胞的成熟，從而觸發(fā)眼表的炎癥循環(huán)機制，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。在干眼等炎癥性疾病中，角膜樹突狀細胞明顯增加[3]。那么其增加的程度與干眼的嚴重程度是否存在相關(guān)性，活化的樹突狀細胞比例有何變化，我們通過角膜激光共焦顯微鏡對其進行定量研究，為臨床評估干眼炎癥程度提供依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 收集我院門診2012～2014年診斷為干眼患者60例，其中男性33例，女性27例，年齡25～58歲，平均年齡41.5歲。根據(jù)2013年干眼臨床診療專家共識，將其隨機分為輕度、中度和重度干眼患者(干眼嚴重程度診斷標準①輕度：輕度主觀癥狀，無角結(jié)膜熒光素染色；②中度：中重度主觀癥狀，有角結(jié)膜熒光素染色，但經(jīng)過治療后體征可消失；③重度：中重度主觀癥狀，角結(jié)膜熒光素染色明顯，治療后體征不能完全消失)，所有患者均為雙眼發(fā)病。所有患者排除病毒性角膜炎、Steven-Johnson綜合征、眼表燒傷等病史及之前的長期眼部應(yīng)用激素、環(huán)孢素、他克莫司、抗生素等眼部用藥病史。

2 研究方法 共焦顯微鏡檢查，重點記錄角膜上皮下樹突狀細胞密度，即計數(shù)每幅共焦顯微鏡圖像中樹突狀細胞數(shù)量，每例患者共計數(shù)三幅圖像中樹突細胞數(shù)量，取其平均值，每幅圖像相當于角膜的實際面積為0.16mm2(即400μm×400μm)，再計算單位面積(1 mm2) 內(nèi)的樹突狀細胞數(shù)量即為樹突狀細胞密度(個/mm2)。同時記錄不同程度干眼患者共焦鏡下活化細胞(具有明顯分支結(jié)構(gòu)的細胞)的比例。

3 共焦顯微鏡檢查 對所有觀察對象用藥前及用藥后1個月進行雙眼的激光共焦顯微鏡檢查并記錄角膜上皮下樹突狀細胞密度。我們使用海德堡 Retina Tomograph III Rostock Cornea Module( HRT Ⅲ RCM) 激光共焦顯微鏡，HRT Ⅲ RCM 縱向分辨率約1 μm，可以實現(xiàn)活體角膜各層的圖像。HRT Ⅲ RCM 的激光光源使用波長670 nm 的二極管激光。檢查前，于結(jié)膜囊下穹隆部滴1 滴10g/L的鹽酸奧布卡因和1 滴凝膠型人工淚液—2 g/L卡波姆( Bausch &Lomb，美國) 。檢查在矢狀軸進行，因此檢查時能夠精確顯示角膜各層結(jié)構(gòu)。對全部研究對象進行角膜中央?yún)^(qū)圖像采集，每個患者在同一檢查層面至少采集3張共焦顯微鏡圖片。所有患者及正常對照組的檢查均有一人完成。全部患者無檢查引起的并發(fā)癥發(fā)生。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對輕度、中度、重度干眼患者的角膜上皮下樹突狀細胞密度及活化細胞比例的分析應(yīng)用方差分析，P<0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

共焦顯微鏡下可見，輕度干眼、中度干眼、重度干眼患者角膜上皮下均可見樹突狀細胞浸潤(圖1～3)，輕度與中度、中度與重度、輕度與重度干眼患者之間比較樹突狀細胞密度均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。隨著干眼程度的加重，其上皮下樹突狀細胞密度呈增加趨勢，見表1。

表1 輕度、中度、重度干眼患者樹突細胞密度值

注：各組之間比較，P<0.05

伴隨干眼發(fā)生，角膜上皮下樹突狀細胞由靜止狀態(tài)(共焦鏡下表現(xiàn)為短棒狀或橢圓形，如圖1-3中黃色箭頭所示)轉(zhuǎn)變成活化狀態(tài)(具有明顯樹突或偽足的細胞，如圖1-3中紅色箭頭所示)，其活化細胞的比例亦隨干眼程度加重而升高，見表2。

表2 輕度、中度、重度干眼患者共焦顯微鏡下活化的樹突狀細胞的比例

注：隨干眼程度加重，其活化細胞的比例隨之增加；采用單因素方差分析，F(xiàn)值為1064.3；各組之間比較，P<0.05

圖1 輕度干眼患者角膜上皮下樹突細胞密度低，多數(shù)細胞處于靜止狀態(tài)

圖2 中度干眼患者角膜上皮下樹突細胞密度增加，部分細胞處于活化成熟狀態(tài)

圖3 重度干眼患者角膜上皮下樹突細胞密集，幾乎所有細胞處于活化成熟狀態(tài)，可見樹突狀或具有偽足的樹突細胞，胞體增大，反光增強

討 論

樹突狀細胞是抗原提呈細胞中加工、處理抗原并將抗原信息提呈給T淋巴細胞最強的一種抗原提呈細胞。這些活化樹突狀細胞主要通過快速釋放大量細胞因子參與免疫應(yīng)答。樹突狀細胞將抗原復(fù)合物提呈給相應(yīng)的CD8+和CD4+T細胞，直接激活T細胞免疫應(yīng)答，T細胞產(chǎn)生IL-2、6等細胞因子，活化巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸粒細胞參與吞噬和免疫反應(yīng)，同時分泌IL-17等刺激上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞分泌多種細胞因子包括FGF、TNF、VEGF等。多種炎癥因子的分泌組成網(wǎng)絡(luò)，作用于自身的角膜、結(jié)膜、淚腺等眼表功能單位，進一步加重局部的炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致干眼的發(fā)生發(fā)展。

目前，受臨床觀察手段限制，很難在活體上觀察到角膜內(nèi)樹突狀細胞。激光共聚焦顯微鏡應(yīng)用于眼科臨床，為我們提供了一種嶄新的檢查手段。使活體觀察干眼等眼表疾病角膜變化成為可能，并應(yīng)用其細胞計數(shù)軟件對樹突狀細胞進行定量分析。在無創(chuàng)條件下，多次、反復(fù)提供角膜及眼表各層組織細胞圖像，為確定疾病性質(zhì)、發(fā)病機制和治療療效評估提供有力依據(jù)。

隨著人們對樹突狀細胞的研究發(fā)現(xiàn)，除了角膜內(nèi)皮層外，角膜上皮層、淺基質(zhì)層內(nèi)均可見樹突狀細胞，上皮層內(nèi)中央及周邊區(qū)均存在樹突細胞[3]。正常人角膜上皮內(nèi)樹突狀細胞的密度從角膜周邊到中央部逐漸降低[4]，不僅密度降低，而且角膜緣和角膜周邊部的樹突狀細胞處于成熟狀態(tài)，中央及旁中央?yún)^(qū)域的樹突細胞則處于未成熟狀態(tài)，亦不表現(xiàn)激活標志。在我們的研究中，重點觀察干眼患者的角膜中央?yún)^(qū)上皮下樹突狀細胞的密度變化和活化成熟狀態(tài)。觀察發(fā)現(xiàn)，干眼患者角膜中央?yún)^(qū)樹突狀細胞密度增加，并且隨著干眼程度的加重，細胞密度呈現(xiàn)上升趨勢，不僅數(shù)量增加，細胞活化成熟，由原來相對靜止的短棒狀、橢圓形細胞變成樹突狀或偽足樣突起的粗大細胞，反光增強[5]，提示炎癥反應(yīng)加重。

此次研究結(jié)果進一步支持2013年我國關(guān)于干眼診療中抗炎治療的規(guī)范，即對于中重度干眼患者除人工淚液外須給予糖皮質(zhì)激素滴眼液、環(huán)孢素滴眼液或他克莫司滴眼液的局部使用，加強抗炎治療。我們在臨床中也觀察到干眼患者經(jīng)過以上抗炎治療后角膜中央?yún)^(qū)上皮下樹突狀細胞數(shù)量減少，細胞趨于靜止狀態(tài)，患者癥狀及體征均減輕。因此，共焦顯微鏡下角膜中央上皮下的樹突狀細胞的密度和形態(tài)功能有助于我們觀察干眼患者的炎癥程度，對抗炎治療后的療效亦能進行有效評估，為治療中應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑提供了客觀依據(jù)[6-7]。

[1] Lemp M，Baudouin C，Baum J，etal. The definition and classification of the dry eye disease :Report of the definition and classification subcommittee of the international dry eye workshop[J].The Ocular Surface，2007，5(2):75-92.

[2] Stern ME，Schauburg CS，Siemasko KF，etal. Autoantibodies contribute to immunopathogenesis of experimental dry eye disease [M] . Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(4):2062-75.

[3] Hattori T，Chauhan SK，Lee H ，etal.Characterization of Langerin-expressing dendritic cell subsets in the normal cornea[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(7):4598-4604.

[4] Zhivov A，Stave J，Vollmar B，etal.In vivo confocal microscopic evaluation of Langerhans cell density and distribution in the normal human corneal epithelium[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol ，2005，243(10)：1056-1061.

[5] Mayer WJ，Mackert MJ，Kranebitter N，etal.Distribution of antigen presenting cells in the human cornea: correlation of in vivo confocal microscopy and immunohistochemistry in differentipathologic entities[J].Curr Eye Res，2012，37:1012-1028.

[6] Wang Y，Zhao F，Zhu W，etal．In vivo confocal microscopicevaluation of morphologic changes and dendritic cell distribution in pterygium[J]．Am J Ophthalmol，2010，150：650-655．

[7] Mayer WJ，Mackert MJ，Kranebitter N. Distribution of antigenpresenting cells in the human cornea：Correlation of in vivo confocal microscopy and immunohistochemistry in different pathologic entities[J]．Curt Eye Res，2012，37(11)：1012-1018．

(收稿：2015-06-18)

Studies on the dendritic cells in the cornealepithelium of dry eye in vivo confocal microscopy Department of Ophthalmol First Hospital of Xi'an

(Xi'an 710002)

Zhu Haifeng Cheng Yan Wu Jie et al

Objective: To objective the density of dendritic cellsand the proportion of activated cells of different degree of dry eye patients in vivo confocal microscopy，so as to investigate the mechanism of dry eye ，to provide the basis for clinical diagnosis and treatment of dry eye.Methods: A case series with 60 consecutive cases of different degrees dry eye patients was investigated，examined with confocal microscopy in vivo，and at the same time the density of dendritic cells and the proportion of activated cells was recorded and analyzed with SPSS17.0 .Results:In mild dry eye，dendritic cell density was 26.7± 8.8/ mm2，with activated cell 29.0±3.7%; In moderate dry eye dendritic cell density was 69.6 ± 11.1 / mm2，with activate cell 83.5±7.6%; In severe dry eye dendritic cell density was 212.2 ± 31.0 / mm2，with activate cell 97.8±1.9%.The data showed that the corneal dendritic cell densityand the proportion of activated cells were found increased in more severe dry eye，with statistically significant difference .Conclusion:In vivo confocal microscope，dendritic cells is an important sign of dry eye inflammation.The proportion of activated cells and its density can be used as effective indicators to assess the degree of dry eye.

Microscopy，confocal Xerophthalmia/diagnosis Dendritic cells Cornea

*陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目(2015SF206)

顯微鏡檢查，共焦 干眼病/診斷 樹突細胞 角膜

R365

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.007