miR-300在漿液性卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義

陜西省腫瘤醫院婦瘤科(西安710061)

袁 淵 姚安梅 周 敏 王 靜

·臨床研究·

miR-300在漿液性卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義

陜西省腫瘤醫院婦瘤科(西安710061)

袁 淵 姚安梅 周 敏 王 靜

目的:探討miR-300在漿液性卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義。方法:收集卵巢癌患者、良性卵巢腫瘤患者及健康婦女各57例的血清標本，提取血清總RNA，通過實時定量PCR檢測血清miR-300的表達水平，并繪制ROC曲線；采用χ2檢驗miR-300的表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系，Kaplan-Meier法分析患者5年總體生存率之間的關系。結果: 卵巢癌患者血清中miR-300的表達水平顯著高于良性卵巢腫瘤患者及健康對照患者，miR-300 ROC曲線下面積0.812 (95%CI:0.761-0.911)，靈敏度為84.6%，特異度為85.3%。血清miR-300的表達水平與漿液性卵巢癌患者的臨床分期密切相關(P=0.0018)，而與年齡(P=0.792)及淋巴結分期(P=0.793)無顯著相關性。血清miR-300高表達的卵巢癌患者5年總體生存率要顯著低于血清miR-300低表達患者。結論: 漿液性卵巢癌患者血清中miR-300表達水平增高，為漿液性卵巢癌的臨床診斷及預后判斷提供了重要參考。

卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的惡性腫瘤，在女性常見惡性腫瘤中占2.4%～6.5%，在女性生殖系統癌中次于宮頸癌和宮體癌。卵巢癌的病因尚不清楚，可能與年齡、生育、血型、精神因素及環境等有關，此外，卵巢癌發病隱匿，早期可無癥狀，晚期常有腹脹、腹大或下腹部包塊、或包塊長大迅速，發現時患者常處于晚期已失去手術機會，往往病程短，病死率高，嚴重威脅著婦女的健康和生命[1]。因此，提高卵巢癌的早期診斷率，給予合理的早期治療，對于提高患者生存質量、降低患者病死率有重要的臨床意義。

MicroRNA (miRNA)是一類進化上保守的非編碼小分子RNA，具有在翻譯水平調控基因表達的功能。研究表明miRNA在腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用。此外，新的研究結果顯示miRNA在血清中穩定表達,腫瘤患者血清中的miRNA可以作為腫瘤診斷的標志物[2-3]。本研究我們將檢測漿液性卵巢癌患者血清中miR-300的表達情況并分析其診斷及判斷預后的價值。

材料與方法

1 材 料 收集2007年6月至2010年6月期間陜西省腫瘤醫院收治的57例漿液性卵巢癌患者、57例良性卵巢腫瘤患者、57例健康體檢者的血清標本，受試者的臨床資料完整，并自愿簽訂了知情同意書。病例納入標準:①患者均經影像學和病理組織學確診為漿液性卵巢癌，均為初診初治患者；②均未接受放、化療及激素等藥物治療；③肝腎功能未見異常；④無其他腫瘤及內科疾病。術后每3個月進行一次隨訪，隨訪截止之間為2015年6月。實驗組漿液性卵巢癌患者年齡28～70歲，其中I-II期23例，III-IV期34例，高分化27例，中/低分化30例；健康對照組年齡27～75歲；良性卵巢腫瘤患者組年齡25～74歲。三組受試者在年齡、生理等一般資料方面比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。空腹采血5ml，真空干燥管中保存，2000r/min，10min 后，-80℃冰箱保存備用。

2 miR-300的提取及反轉錄 按照北京天根生化科技有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒所述步驟提取miRNA。紫外分光儀檢測RNA濃度及純度。應用TaKaRa公司的特異性miRNA反轉錄引物并按照反轉錄試劑盒步驟合成cDNA，每個反轉錄體系中含有10 ng 的RNA模板。反轉錄的條件: 15℃ 20 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。

3 RT-qPCR 反應條件：95℃ 10s，95℃20 s，62℃ 40s，40個循環。采用的相對定量法計算miR-300的相對表達量(F)，F = 2-△ct，△ct =ctmiR-300-ctU6，其中ct為每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。

4 血清CA125含量檢測 使用全自動化學發光分析系統的AXSYM生化分析儀及配套CA125檢測試劑對血清 CA125 進行檢測，參考值為0～35 U/ml。

結 果

1 miR-300在漿液性卵巢癌患者血清、良性卵巢腫瘤患者血清、和健康對照血清中的表達水平差異 通過RT-qPCR檢測漿液性卵巢癌患者血清、良性卵巢腫瘤患者血清、和健康對照血清中miR-300 的表達水平，結果顯示漿液性卵巢癌患者血清中miR-300的表達水平顯著高于良性卵巢腫瘤患者及健康對照患者，差異有統計學意義(漿液性卵巢癌組vs良性卵巢腫瘤組：P<0.001；漿液性卵巢癌組vs健康對照組：P<0.001)，而在良性卵巢腫瘤患者與健康對照組血清中miR-300的表達比較差異無統計學意義(良性卵巢腫瘤組vs健康對照組：P=0.069)，如圖1。

圖1 漿液性卵巢癌患者、良性卵巢腫瘤患者及健康對照血清中miR-300的表達水平

2 血清miR-300表達水平與漿液性卵巢癌患者臨床病理特征的關系 將57例漿液性卵巢癌患者按照病例特征因素(年齡、淋巴結轉移、臨床分期、細胞核分化程度)進行分類，進一步分析血清miR-300相對表達量與漿液性卵巢癌患者臨床特征的關系。卡方分析結果顯示，血清miR-300的表達水平與漿液性卵巢癌患者的臨床分期密切相關，隨著漿液性卵巢癌患者臨床分期的進展，血清miR-300的表達亦逐漸升高，兩組間差異有統計學意義(P=0.0018)。此外，血清miR-300在漿液性卵巢癌細胞核中/低分化組的表達顯著高于細胞核高分化組，兩組差異有統計學意義(P=0.003)。血清miR-300的表達與漿液性卵巢癌其他臨床病理特征，包括年齡、淋巴結分期均無顯著相關性，組間比較差異無統計學意義(年齡>60 歲vs年齡<60歲：P=0.792；淋巴結轉移組vs淋巴結無轉移組：P=0.793)，見附表。

3 血清miR-300表達水平在漿液性卵巢癌中的診斷效率 根據上述血清miR-300的表達水平，建立miR-300和CA125的ROC曲線，利用ROC曲線評價兩者在卵巢癌中的診斷價值。結果顯示，miR-300 ROC曲線下面積0.812 (95%CI:0.761-0.911)，靈敏度為84.6%，特異度為85.3%； CA125ROC曲線下面積為0.849 (95%CI:0.764-0.927)，靈敏度為92.9%，特異度為84.2%，如圖2。血清miR-300和CA125均具有較好的診斷價值。

附表 血清miR-300表達與患者臨床病理特征關系

圖2 血清miR-300及CA125診斷卵巢癌ROC曲線

4 血清miR-300表達與漿液性卵巢癌患者生存之間的關系 生存分析結果顯示，血清miR-300表達與漿液性卵巢癌患者術后5年總體生存率密切相關，血清miR-300高表達的漿液性卵巢癌患者術后5年總體生存率顯著低于血清miR-300低表達的漿液性卵巢癌患者，差異有統計學意義(P=0.0114)，如圖3。

圖3 血清miR-300表達與患者術后5年總體生存率關系

討 論

miRNA是含有莖環結構的miRNA前體，經過Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子(18～25個核苷酸)，通過與靶基因的種子區序列相互配對抑制其基因的轉錄或翻譯行使其功能，廣泛存于真核生物體中[4]。近年來，大量研究表明，miRNA調控機體多種生理和病理過程，參與細胞的增殖、凋亡、分化、代謝等生物進程，與腫瘤的發生、發展侵襲、轉移等密切相關[5]。研究發現mi RNA 在多種腫瘤組織中均有特異性的表達譜[6-7]，參與腫瘤發生、發展、轉移的各個階段，且每一個階段都有相應的基因發生改變，同時也有調控這些基因的miRNA發生變化[8]。有研究發現循環血液中的RNA包被于一種含有外泌體、凋亡小體、微泡、凋亡微粒體的微粒中，以此可以逃避RNA酶的降解，穩定存在于循環血液中[9]。近年來，血清中游離miRNA的早期診斷價值在肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等常見腫瘤中得到了良好的驗證[10-12]。因此，血清中游離miRNA被認為是有價值的腫瘤檢測指標之一，能夠穩定地被檢測并且提示腫瘤狀態，使miRNA成為新的腫瘤標志物具有良好的應用前景[13]。

miR-300是長度為22個核苷酸的非編碼RNA分子，研究顯示miR-300與多種腫瘤密切相關。Xu XH等人研究發現在乳腺癌中miR-300通過靶向作用于P53促進乳腺癌的增殖[14]。在骨腫瘤中miR-300表達上調，并且靶向作用于BRD7分子促進細胞的增殖及侵襲[15]。我們通過檢測漿液性卵巢癌患者血清中miR-300的表達情況，發現miR-300可作為漿液性卵巢癌治療及預后的分子指標。

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(收稿：2015-07-18)

Expression and clinical significance of serum miR-300 in serous ovarian cancer patients Department of Gynecological Oncology，Shaanxi Provincial Tumor Hospital

(Xi’an 710061)

Yuan Yuan Yao Anmei Zhou Min et al

Objective:To investigate the expression and clinical significance of serum miR-300 in serous ovarian cancer patients．Methods: Collected serum samples of 57 newly diagnosed serous ovarian cancer patients，57 benign ovarian tumor patients，and 57 healthy women. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect the expression of serum miR-300. Diagnostic value of serum miR-300 in serous ovarian cancer was analyzed by the receiver operating characteristic (ROC) curve. Meanwhile，the relationships between serum miR-300 expression and clinicopathological features serous ovarian cancer was analyzed by χ2 test. The association of serum miR-300 expression and 5-years overall survival of serous ovarian cancer was analyzed by Kaplan-Meier method．Results: The expression of serum miR-300 of serous ovarian cancer patients showed statistically higher than controls. The area under the ROC curve (AUC) was 0.812 (95%CI:0.761-0.911)．miR-300 screening ovarian cancer sensitivity rate was 84.6%，specificity rate was 85.3%. The serum miR-300 expression was significantly correlated with clinical stage (P=0.0018), but had no significant correlation with age(P=0.792) and lymph node staging (P=0.793). 5-year overall survival rate of patients with high serum miR-300 expression was significantly lower than patients with low serum miR-300 expression. Conclusion: The relative expression level of serum miR-300 was significantly increased in patients with ovarian cancer，which indicated serum miR-300 was a promising diagnostic and prognostic biomarker in serous ovarian cancer.

@miR-300 Ovarian neoplasms/pathology Prognosis Diagnosis

@miR-300 漿液性卵巢腫瘤/病理學 預后 診斷

R737.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.008