主動外排機制和膜蛋白缺失在粘質沙雷菌耐藥中的研究*

西電集團醫(yī)院 (西安710077)

李 欣 汪建軍△ 任超杰 扈會整 王 欣

主動外排機制和膜蛋白缺失在粘質沙雷菌耐藥中的研究*

西電集團醫(yī)院 (西安710077)

李 欣 汪建軍△任超杰 扈會整 王 欣

目的： 研究粘質沙雷菌的耐藥性與細胞的主動外排機制及細菌膜蛋白缺失相關性。方法： 收集對亞胺培南和美羅培南耐藥的粘質沙雷菌株15株，應用PCR擴增和DNA序列分析，采用E試驗觀察氰氯苯腙對亞胺培南最低抑菌濃度(MIC)的影響，以研究細胞內(nèi)是否存在主動外排機制和膜蛋白缺失現(xiàn)象。 結果： 當CCCP存在時，其中7株粘質沙雷菌亞胺培南，美羅培南的 MIC 值下降，提示存在主動外排機制。其中有1株OprD2蛋白缺失，1株外排泵MexB基因陽性。 結論： 耐碳青霉烯類藥物的粘質沙雷菌的耐藥性與細胞的主動外排機制和膜蛋白缺失有關。

粘質沙雷菌(Serratia marcescens)是革蘭陰性小桿菌，單個或短鏈存在，常存在于人體泌尿道和呼吸道，在兒童胃腸道貯菌也比較常見。當機體免疫力下降時，常能引起敗血癥、肺炎、腦膜炎等各種感染性疾病，且對多種抗生素表現(xiàn)耐藥。近年來出現(xiàn)了耐亞胺培南和美羅培南粘質沙雷菌菌株。粘質沙雷菌是引起院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一，并出現(xiàn)散播情況，給臨床治療和院內(nèi)感染控制帶來了極大的挑戰(zhàn)[1]。粘質沙雷菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制[2]，是否與細胞內(nèi)存在主動外排機制有關，我們對此作了相應的試驗和基因分型。

材料與方法

1 材 料

1.1 菌株來源與質控菌株：收集2010～2014年從咸陽地區(qū)初次培養(yǎng)亞胺培南(IMP)和美羅培南(MPM)耐藥的粘質沙雷菌15株，大腸埃希菌ATCC25922為實驗的質控菌株。

1.2 設備和試劑：Eppendorf centrifuge5417R低溫離心機；MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research)；Bio-Rad電泳儀及成像系統(tǒng)；瓊脂糖購自Oxoid公司；100 bp DNA梯帶標志物購自大連寶生物公司；氰氯苯腙(CCCP)終濃度5 mg/L購自Sigma公司；IMP E test試條購自瑞典AB Biodisk公司；M-H培養(yǎng)基購自杭州天和生物公司；菌種及藥敏鑒定使用VITEK-2全自動細菌藥敏鑒定系統(tǒng)及配套試劑(法國梅里埃公司)；PCR擴增試劑購于上海生物工程有限公司。

2 方 法

2.1 CCCP(羰基氰氯苯腙)抑制作用：在血瓊脂平板上接種細菌，35℃培養(yǎng)24h后，挑取2～3個菌落，用生理鹽水充分混勻，并調(diào)節(jié)濁度為0.5個麥氏單位，按K-B法涂滿整個含有CCCP(濃度為5mg/L)的M-H瓊脂平板和一般M-H瓊脂平板，并貼上E-test試紙條，35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察CCCP對IMP的MIC的逆轉作用。當存在CCCP時IMP的MIC比不含有CCCP時IMP的MIC下降1/3，提示存在主動外排機制，否則提示不存在主動外排機制。

2.2 基因檢測方法：oprD2基因熱循環(huán)參數(shù)為93℃預變性2min→93℃60s→55℃40s→72℃90s，最后一個72℃延伸5 min，共循環(huán)35周期。其余基因熱循環(huán)參數(shù)為：93℃預變性2min→93℃60s→55℃40s→72℃90s，最后一個72℃延伸5min，共循環(huán)35周期；純水作為陰性對照。耐藥基因檢測試劑盒購自上海生物工程公司。應用PCR方法檢測，引物序列見附表。

附表 基因引物序列

結 果

1 基因檢測結果 15株耐碳青霉烯酶的粘質沙雷菌經(jīng)上述幾種基因進行擴增并檢測，結果有1株OprD2蛋白缺失，1株外排泵MexB基因陽性，其他未擴增出，擴增結果見附圖。

附圖 基因擴增結果(1.OprD2,2. MexB,3.陰性對照,

4.M為100bp DNA梯帶)

2 CCCP存在與否對IMP體外抗茵活性的影響 15株IMP和MPM耐藥的粘質沙雷菌株中，有6株外排泵表型試驗陽性，CCCP存在使IMP的MIC下降至4個濃度梯度的菌株有4株，下降至3個濃度梯度的菌株有1株，CCCP存在使MPM的MIC下降至4個濃度梯度的菌株有3株，其中有2株菌同時對兩種藥物有明顯外排作用，其余菌株在CCCP存在與否IMP(MPM)的MIC值無變化。

討 論

粘質沙雷菌廣泛存在與自然界，為條件致病菌，是引起腸道感染的主要病原菌，與許多醫(yī)院的院內(nèi)感染暴發(fā)流行有關，能夠引起多種疾病，如：呼吸道疾病、尿路感染等。近幾年，由于抗生素的不合理使用，粘質沙雷菌對抗生素的耐藥呈蔓延趨勢，且耐藥基因復雜多樣，耐藥程度也日趨嚴重，耐藥菌的治療成為一個嚴重的問題。本研究主要對15株IMP和MPM耐藥的粘質沙雷菌的膜蛋白缺失和主動外排進行檢測，并探討其耐藥機制。

外膜孔蛋白OprD分為1型和2型，研究表明：與IMP耐藥有關的為外膜孔蛋白OprD2，IMP由于分子小，通過外膜蛋白孔道可選擇性快速進入菌體，與菌體的特異性位點進行結合，起到抗菌作用。當外膜通透性下降，外膜蛋白的改變、減少或缺失 ，使抗菌藥物不能進入菌體，從而產(chǎn)生耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)：15株耐碳青霉烯酶類藥物粘質沙雷菌中，OprD2基因缺失1株。結果表明：OprD2基因缺失不是本組耐藥的主要原因，但不排除因OprD2基因突變或基因表達下調(diào)，從而導致粘質沙雷菌對IMP耐藥。

粘質沙雷菌細胞膜上的主動外排蛋白包括外膜通道蛋白、內(nèi)膜蛋白和膜連接蛋白，主動外排蛋白是導致粘質沙雷菌對多種抗菌藥物表現(xiàn)為多重耐藥的主要原因。粘質沙雷菌細胞膜上的這些主動外排蛋白組成了主動外排系統(tǒng)，主要有AcrAB[4]、SdeXY[5-6]、SmdAB[7-8]、SmfY[9]及SdeCDE[8-10]系統(tǒng)。我們研究了粘質沙雷菌的外排泵基因MexR、MexB、acrB、acrA，其中MexB基因陽性一株。CCCP為質子泵抑制劑，能破壞細菌跨胞漿膜的質子梯度，導致轉運蛋白失去能量供應而起作用。一般認為CCCP作用使粘質沙雷菌對IMP的MIC下降至1/3，表明細菌可能存在泵出機制，我們研究有6株外排泵表型試驗陽性，說明細菌存在主動外排系統(tǒng) ，此系統(tǒng)可以將已進入細菌胞質的抗菌藥物排出菌體外，使臨床上治療失敗。粘質沙雷菌對常用抗菌藥物及對碳青霉烯類藥物耐藥的機制復雜，膜孔蛋白OprD2基因缺失以及外排泵出機制存在是其重要的耐藥機理。

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(收稿：2015-06-04)

Study on the active efflux mechanism and the absence of membrane proteins in Serratia marcescens resistence

Xidian Group Hospital (Xi’an710077)

Li Xin Wang Jianjun Ren Chaojie et al

Objective：Study the drug resistance of Serratia marcescens whether related to the cells active efflux mechanism and the absence of bacterial membrane proteins or not. Methods：collected 15 strains Serratia marcescens that resist Imipenem and Meropenem ,application PCR amplification and DNA sequence analysis. adopt E test experiment observe the influence of CCCP for Imipenem minimal inhibitory concentration. in order to study intracellular was exist active efflux mechanism and the absence of membrane proteins or not. Results：When CCCP exist, there were 7 strains serratia marcescens for imipenem and Meropenem’MIC value decreased, prompting exist active efflux mechanism bacterial, and 1 strain absent OprD2protein, 1 strain efflux pump MexB gene positive. Conclusion：The resistance of Serratia marcescens that resist Carbapenemase related to the cells active efflux mechanism and the absence of bacterial membrane proteins .

Serratia marcescens Imipenem @MexB gene @OprD2protein Drug resistance,bacterial

*陜西省科學技術研究發(fā)展計劃項目(2014K11-02-03-09)

粘質沙雷菌 亞胺培南 @MexB基因 @OprD2蛋白 抗藥性，細菌

R446.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.029

△陜西省核工業(yè)215醫(yī)院