代謝組學技術及其在針灸關鍵科學問題研究中的應用

鄧淑芳 吳巧鳳 楊明曉 陳 亮 陳 琳 賴禎宏 莊 藝 于 正 梁繁榮

(成都中醫藥大學針灸推拿學院，成都，610075)

代謝組學技術及其在針灸關鍵科學問題研究中的應用

鄧淑芳 吳巧鳳 楊明曉 陳 亮 陳 琳 賴禎宏 莊 藝 于 正 梁繁榮

(成都中醫藥大學針灸推拿學院，成都，610075)

隨著針灸現代化、國際化的發展，用現代科技手段闡明針灸經典理論的科學內涵成為世界傳統醫藥研究的重點，代謝組學是系統生物學的重要組成部分并被廣泛應用于多個領域，針灸與代謝組學技術的有機結合成為必然。通過對代謝組學的研究方法、分析策略與技術及在針灸關鍵科學問題研究中的應用現狀等進行分析與論述,提出將代謝組學技術引入針灸學研究，對于發展針灸理論、提高針灸臨床療效，促進針灸學的現代化和國際化發展有著十分重要的科學意義和臨床實用價值。

代謝組學；針灸；作用機制；針灸現代化

代謝組學(Metabonomics/Metabolomics)是對某一生物、細胞在某一特定生理時期內所有低分子量代謝產物同時進行定性和定量分析的一門科學，是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學之后系統生物學的另一重要分支與研究領域，該研究具有整體性和動態性的特點。隨著代謝組學在醫療、衛生領域的廣泛應用，針灸與代謝組學技術的有機結合成為新的研究方向。大量研究表明，機體接受針灸刺激所產生的作用是多途徑、多環節、多層次、多靶點的整體性調節作用，與代謝組學技術的優勢特點有很大一致性,符合針灸研究需要，代謝組學借助現代分析技術、化學計量學和生物信息學技術，從全局的角度揭示針灸的調節機制。因此，采用代謝組學技術研究針灸的基礎理論和作用機理，有望為針灸的治療效應提供更符合機體實際情況的證據，為針灸的基礎研究提供指引和參考，揭示針灸現代科學內涵。

1 代謝組學研究的生物樣品及影響因素

代謝組學研究常用的生物樣本是生物體的各種體液，如血漿或血清、尿液、腦脊液、唾液等，以及生物組織樣品[1]，糞便提取物[2]，細胞提取液，細胞培養液等。

生物樣品的采集是代謝組學研究的初始步驟，生物樣本自身的質量往往決定了代謝組學研究的可靠性和價值。在實驗設計時，要充分考慮到代謝組學的影響因素，影響生物樣本質量的主要因素包括樣本種類、采集時間、采集部位、樣本數、前處理方式等。如在研究人類樣本時，需考慮組間的性別、年齡、飲食、環境、運動[3]等；在選取實驗動物時應選取品種、性別相同、周齡、體重相近的動物[4-5]。

2 生物樣品的預處理

樣品的預處理是整個代謝組學研究中的重要內容，應該根據不同的化合物選擇不同的提取方法，并對提取條件進行優化，除去干擾雜質，將樣品轉化為適合測定的物質形式，以提高儀器檢測時的靈敏度和選擇性[6]。基于代謝組學分析的系統性，整個提取和預處理樣品的操作過程應盡可能保留和體現樣品中代謝物組分的完整信息[7]。

3 代謝組學的分析技術

目前，代謝組學主要的分析技術如核磁共振(NMR)、色譜、MS等在代謝組學研究中得到了廣泛的應用[8]。表1列出了代謝組學分析技術部分典型研究案例。

表1 代謝組學分析技術的部分典型研究案例

3.1 NMR技術 NMR是代謝組學應用研究普遍的方法。NMR方法有如下優點：1)無損傷性，既不會破壞樣品的結構和性質，也無輻射損傷；2)能夠在接近生理條件下進行實驗，可在一定的溫度和緩沖液范圍內選擇實驗條件；3)可對樣品進行實時和動態的檢測;4)可設計多種編輯手段，實驗方法靈活多樣；5)樣品處理簡單，尿液和血清是經常使用的樣品；6)NMR譜中信號強度與樣品濃度成正比，可以對代謝物進行定量分析[9]，對所有化合物的靈敏度是一樣的。因此，NMR技術適合代謝產物中復雜混合成分的研究。

同時，NMR技術也有一定的缺點：1)與質譜相比，其靈敏度低，對高通量差異較大的樣品同時檢測難度大，因此，在采集樣品時往往需要使用500MHz、600MHz甚至更高場強的NMR儀；2)核磁譜中內源性物質多，代謝物譜峰重疊嚴重，影響對代謝物的定性及定量分析；3)測量的動態范圍窄；4)儀器的成本高。

劉等[10]通過核磁共振1H譜(1HNMR)技術檢測乳腺纖維瘤患者及乳腺浸潤性導管癌患者的血清代謝組特征，分別采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別法(OPLS-DA)分析二者之間的代謝差異，結果顯示與乳腺纖維腺瘤患者相比，浸潤性導管癌患者血清中脂質、乳酸鹽、磷脂酰膽堿/甘油磷脂酰膽堿的含量升高，而谷氨酰胺、牛磺酸、肌酸和葡萄糖含量降低，兩種疾病在血清代謝組上具有明顯的代謝差異，這些具有明顯變化的代謝物可作為潛在血清代謝標記物，為臨床區分良惡性腫瘤提供了參考。

3.2 色譜-質譜聯用技術 與NMR相比，色譜-質譜聯用技術具有靈敏度高、分離效率高、分析時間短、處理樣品簡便等特點，可以對樣品進行高通量分析。

3.2.1 GC-MS技術 GC-MS是測量小分子代謝物的首選方法，尤其是初級代謝產物，如有機酸、氨基酸等，具有高精密度、靈敏度及耐用性[11]，與LC-MS相比，主要的優勢在于有標準質譜圖庫輔助代謝物鑒定，易對代謝物進行定性。

GC-MS不足之處在于只能對揮發性和熱穩定性好的組分進行分析，由于大多數代謝產物是不能揮發的，不能直接進樣分析，因此，對于難揮發或熱不穩定的樣品要進行衍生化處理，轉化成相應的揮發性衍生物以滿足GC/MS檢測。如Zeng等[12]采用GC-MS檢測正常體重、超重和肥胖兒童的血漿樣本，通過分析代謝指紋圖譜發現這3組樣本的代謝模式是不同的，經過進一步的非相關線性判別分析和典型相關分析發現了與肥胖相關的潛在生物標志物。但在衍生化過程中，也極易出現分析結果的多變性，并使樣品的色譜圖復雜化，其中以重峰、多底物現象最為常見，這些現象影響后續數據處理，曲解生物標記物和代謝通路，從而影響代謝組學結果生物意義的闡釋。Wang等[13]提出采用獨立成分分析方法，分解相互獨立的信號分量，有助于多種代謝物的鑒定。全二維氣相色譜-飛行時間質譜(GC×GC-TOF/MS)適合于復雜樣品的分離分析。Hantao等[14]運用GC×GC-TOF/MS對先天性新陳代謝異常患者尿液中的有機酸進行了分析，結果發現某些特定的有機酸(如巴豆酰甘氨酸等)可以作為這種疾病診斷的標志物，并且證明了GC×GC-TOF/MS用來定量分析的有效性。Zhang等[15]采用GC-MS結合多元統計分析對飲食誘導的高脂血癥大鼠代謝物進行分析，結果發現了潛在的生物標記物有：β-羥基丁酸、酪氨酸和肌酸酐。這說明利用代謝組學去識別病理生理狀態有可能建立一個新的早期診斷人類疾病的方法學。

GC-MS技術被廣泛運用，許多計算機工具也隨之應運而生，其中，自動質譜圖解卷積系統(The Automated Mass Spectral Deconvolution System，AMDIS)是最常用的代謝物定性定量軟件。然而，AMDIS易出現假陽性，并且沒有一個接口適合于高通量數據分析，盡管其他的計算機工具可以處理AMDIS的結果使其正常化，并可進行代謝組學數據的統計分析，但GC-MS還沒有獨立的免費軟件可以定性和定量代謝物。Aggio等[16]將MetaBox與AMDIS軟件進行對比，評估其實用性和潛力，結果發現，MetaBox相對于AMDIS出現了較低的假陽性率和假陰性率，并能夠報告出更高一些的與雌雄小鼠代謝相關的潛在生物標志物。

3.2.2 LC-MS技術 LC-MS適用樣品范圍較廣，現在大多數藥物和外源性代謝產物的研究都用此技術。與GC-MS相比，LC-MS具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度高的特點，同時不受樣品揮發性和熱穩定性的限制，無需衍生化處理。LC-MS雖然缺少標準譜圖數據庫，但可以通過它獲得代謝物精確的分子質量數，在通過數據庫進行檢測確定分子的結構信息[17]。LC-MS主要的缺點是共流出峰間的離子抑制/誘導作用、基質效應等問題。

于等[18]建立了大鼠膽汁中氧化白藜蘆醇的液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)檢測方法，測定了灌胃給藥氧化白藜蘆醇50 mg·kg-1后不同時間段內大鼠膽汁中的含量，0.5～1 h給藥后膽汁中的藥物排泄量最高，隨時間推移排泄量逐漸下降，12 h內藥物總排泄量約為總給藥量的0.737%，實驗結果表明LC-MS/MS分析方法耗時短(每個樣品僅用3 min),專屬性強，且準確度和精確度均可滿足體內藥物分析的要求。Kelly等[19-20]發展了一種基于酰胺柱或氨基柱HILIC分離結合正、負離子模式切換MRM檢測的靶向代謝組學方法，分析了血、尿、細胞及組織等樣本里的258種代謝物。此方法一次性可檢測的代謝物數目還可再擴增，可達350個左右。Gaikwad等[21]結合液液萃取建立了乳腺組織中甾體化合物的LC-MS/MRM分析方法，該法可在12 min內檢測女性乳腺組織中的100種甾體激素及其結合物，結合不同機制的色譜分離模式，可以擴大靶向代謝組學的檢測覆蓋面，達到接近于非靶向代謝組學全譜檢測的效果。

可見，代謝組學技術在醫學領域的廣泛應用，不僅可用于輔助疾病的診斷，而且還可以評估疾病的臨床病程等，通過對代謝譜的了解，還可以揭示疾病的生理病理機制。盡管代謝組學技術仍存在自身缺點，但隨著社會的進步和研究的深入，相信代謝組學也將迎來更為廣闊的前景。

4 代謝組學在針灸關鍵科學問題研究中的應用

4.1 代謝組學在針灸效應機制中研究 針灸作為一種補充替代療法，越來越受到人們的青睞，但其分子機制和生物途徑仍不清楚，現代科學研究的證據不足，在一定程度上阻礙了針灸現代化的進程。代謝組學是從尋找單一生物標志物轉向尋找特異性的一組代謝標志物群，進而反映檢測樣本中所有代謝物的信息，并且與當代快速發展的代謝網絡研究相結合，契合了針灸多指標、多層次、多靶點的研究需要，可對闡釋針灸效應規律和生物學基礎提供有價值的信息。

韓等[22]基于四級桿-飛行時間質譜(Q-TOF)代謝組學方法，探討了脾虛型腸易激綜合征(IBS)患者隔藥灸臍法治療前后尿樣的代謝產物譜特征，研究結果發現患者的代謝譜發生了顯著性變化，其中變化較為顯著的是氨基酸、膽汁酸、兒茶酚胺類及內源性大麻素代謝物，這些代謝物涉及到體內的氨基酸代謝、神經遞質代謝及內源性大麻素代謝等過程。Yan等[23]針刺足三里，顯著改變的五個代謝通路是：α-亞麻酸代謝，谷氨酸鹽和谷氨酸酯代謝，檸檬酸循環、丙氨酸和谷氨酸鹽代謝，以及維生素B6代謝途徑明顯被擾動，還有53種不同的代謝產物被認為與闡明足三里的生理基礎和機制相關，并提出尿液代謝譜是研究針灸分子機制的一種很有前途的方法。Zhang等[24]使用代謝組學的方法檢測發現卵巢切除術引起大鼠體內脂質過氧化，糖酵解，三羧酸循環，膽固醇和氨基酸代謝異常，而不管是使用穴位激光照射還是穴位埋線的方法都可以改善紊亂的代謝，且效果優于激素治療。Wu等[25]通過基于NMR的代謝組學方法研究針刺的生物學效應，研究發現針刺功能性消化不良患者可顯著改變亮氨酸/異亮氨酸、乳酸、葡萄糖的含量。Wu等[26]進一步研究發現老化促進小鼠血漿內的乳酸鹽明顯減少，其他的改變包括二甲胺膽堿，葡萄糖升高，亮氨酸/異亮氨酸、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白/及低密度脂蛋白、3-羥基丁酸和氧化三甲胺減少。電針治療后，乳酸鹽、二甲胺膽堿和氧化三甲胺的含量上升。更有學者通過研究發現，針灸可以恢復代謝網絡。Wen等[27]采用基于超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)代謝組學技術分析急性痛風性關節炎大鼠的尿液和血漿，探討針刺治療急性痛風性關節炎的生物學效應和潛在的機制，結果發現針刺可以恢復代謝網絡，并認為利用UPLC-MS代謝組學技術將為研究針刺治療急性痛風性關節炎的生物效應提供一個獨特視角。楊等[28]運用1H-NMR技術研究足陽明經穴位電針療法對潰瘍性結腸炎大鼠大腦皮層代謝物的影響，結果發現，電針干預后潰瘍性結腸炎大鼠模型腦皮質中乳酸、谷氨酸、TC和VLDL均升高，而丙氨酸和LDL含量降低。這一結果表明，針刺治療潰瘍性結腸炎有其特定的代謝組學物質基礎和機制。

以上證據表明利用代謝組學技術可以進一步去理解疾病的發病機理以及針刺效應的發揮，針灸的作用機制可能是對患者體內紊亂的代謝途徑進行良性調節，恢復了代謝網絡，針灸治療后引起的各類代謝物變化的作用可能與針灸提高大腦的能量代謝、蛋白合成及各種化學反應有關。

4.2 應用代謝組學進行經穴效應特異性研究 經穴效應特異性作為針灸經典理論的核心和提高針灸療效的關鍵，已成為國際針灸研究最重要的熱點領域。因此，深入研究和闡明經穴效應特異性基本規律及其科學內涵，符合我國衛生事業和社會發展的重大需要。吳等[29]采用基于核磁共振(1HMR)和模式識別技術的代謝組學方法分別觀察針刺陽明經穴與他經穴位對健康男性尿液代謝產物的影響，從針刺對機體代謝流影響的角度探討陽明經穴的特異性，結果發現針刺陽明經穴對機體尿液代謝物的影響基本一致，均可以升高尿液中馬尿酸和氧化三甲胺的含量，降低甘氨酸含量，針刺陽明經穴與針刺陽陵泉對尿液代謝物的影響差別不大，但與針刺委中后的差異明顯，從針刺對機體代謝譜影響的角度探討了陽明經穴的特異性。吳等[30]另一個研究發現針刺足三里、天樞、上巨虛對潰瘍性結腸炎大鼠腦皮層代謝物有明顯影響，特別是對是對水溶性代謝物的影響更明顯，對脂溶性代謝產物影響較小，其中，乳酸、磷酸肌酸、N-乙酰天冬氨酰谷氨酸、低密度脂蛋白等代謝物是針刺經穴作用的關鍵代謝物；而針刺非經非穴對潰瘍性結腸炎大鼠腦皮層代謝物的影響主要表現在γ-氨基丁酸、纈氨酸等，這些數據表明針刺非經非穴的腦代謝與經穴組存在著差異，提示采用經穴針刺治療潰瘍性結腸炎具有一定的腦特異性代謝物質基礎。

5 討論

目前，代謝組學研究日漸成熟，其關注的是各種代謝路徑底物和產物的小分子代謝物，反映細胞或組織在外界刺激或是遺傳修飾下代謝應答的變化，可整體性反映機體的功能狀態，與針灸的整體性調節特點具有異曲同工之處。因此，我們認為，將代謝組學技術引入針灸學研究，一則可以識別疾病潛在的生物標志物，對病理生理過程有一個更深入的了解，二則可為針灸基礎研究提供更科學、更符合針灸作用規律的證據，并全面、系統地揭示針灸學的科學內涵，促進針灸現代化。因此，代謝組學技術不僅可能成為中西醫溝通的紐帶，同時將是揭示中醫理論科學內涵的有效工具。

隨著對代謝組學的深入研究，各種影響代謝組學研究的細節因素和技術瓶頸也逐步被揭示，怎樣保證代謝組學研究結果的可靠性、重現性、科學性是我們現在所面臨的“瓶頸問題”。目前，用于代謝組學數據處理的商品化軟件應運而生。例如MetaboAnalyst、MZmine、XCMS等可處理GC/MS和LC/MS數據，MestreNova、XwinNMR、MesReC等可處理NMR數據。但研究發現，雖然這些軟件可以被用來處理數據，但其科學性值得探究。Koh等[31]基于GC/MS代謝組學技術，通過Calibration feature、Statistical Compare、MetAlign、MZmine這幾種軟件對數據進行預處理，比較不同軟件的峰對齊準確度，結果發現不同軟件準確度都不能達到100%，且存在差異，對實際生物樣本數據處理后所構建的OPLS-DA模型的預測能力也存在差異。因此，在實際工作中，我們需慎重選擇合適的軟件處理數據，并在軟件處理的基礎上，更應仔細核對信息，以確保代謝組學數據真實可靠。

此外，代謝組學作為系統生物學的重要組成部分，其研究領域、研究思路及研究技術都有待開拓和創新，如將細胞、動物研究所獲得的研究結論充分的轉化到人體樣本研究中；將代謝組學的數據與其他組學(如蛋白組學、基因組學、轉錄組學等)多組學數據融合，并與臨床相關數據結合，以此發現包含了不同數據內容的復合生物標志物；開發更有效的代謝組學數據分析技術等等。因此，我們相信，將代謝組學技術與針灸研究有機結合，在針灸基礎與臨床研究的思路與方法上有所創新，隨著技術的進步和成熟，針灸與以代謝組學為核心的系統生物學結合，將會對針灸的現代化研究帶來新的突破。

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(2015-03-02收稿 責任編輯：洪志強)

Applying Metabolomics Technology in Solving Scientific Problems of Acu-moxibustion

Deng Shufang, Wu Qiaofeng, Yang Mingxiao, Chen Liang， Chen Lin, Lai Zhenhong，Zhuang Yi, Yu Zheng, Liang Fanrong

(AcupunctureandMoxibustionCollege,ChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China)

With the modernization and globalization of acupuncture and moxibustion, scientifically explaining the classical theory of acupuncture and moxibustion becomes one of the focus of the traditional medicine researches. Metabonomics is an important method of systematic biology and has been widely applied in many fields. Recently, it is an inevitable trend to combine acupuncture and moxibustion and metabonomics to investigating the mechanism of acupuncture. In this review, we summarized the advanced detecting methods of metabonomics, the analysis strategies and software of metabonomics and its current application status in the key scientific problems of acupuncture and moxibustion. In conclusion, we believe that metabonomic method will bring new directions for acupuncture research as well as clinic practice, in supportive of its modernization and globalization.

Metabonomics; Acupuncture; Mechanism; Modernization of Acupuncture

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(編號：2012CB518500)；國家自然科學基金項目(編號：81373737)

鄧淑芳(1988—)，女，碩士研究生在讀，研究方向：經穴效應循經特異性規律及關鍵影響因素基礎研究，E-mail:405144142@qq.com

梁繁榮(1956—)，男，教授，博士生導師，研究方向：經穴效應特異性規律的臨床與基礎研究，E-mail：acuresearch@126.com

R245-3

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.002