腦復明滴丸對血管性癡呆大鼠學習和記憶能力的影響

杜慶紅 徐 雅 李衛紅 狄 波 李雅潔

(北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029)

實驗研究

腦復明滴丸對血管性癡呆大鼠學習和記憶能力的影響

杜慶紅 徐 雅 李衛紅 狄 波 李雅潔

(北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029)

目的：探討腦復明滴丸對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的影響。方法：采用雙側頸總動脈結扎建立血管性癡呆模型，以安理申作為陽性對照藥物。60只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、腦復明滴丸高劑量組、腦復明滴丸中劑量組、腦復明滴丸低劑量組、陽性藥對照組。采用Morris水迷宮試驗和跳臺實驗檢測大鼠的學習記憶能力。結果：在Morris水迷宮實驗中，腦復明滴丸可顯著縮短總路程與逃避潛伏期，并且顯著延長癡呆大鼠在目標象限的停留時間。在跳臺實驗中，腦復明滴丸能夠顯著縮短癡呆大鼠的潛伏期。結論：腦復明滴丸對血管性癡呆大鼠學習和記憶功能有改善作用。

腦復明滴丸；血管性癡呆；學習記憶

腦復明滴丸是基于中醫“毒損腦絡”的病機理論，由梔子、三七有效部位制成的現代中藥。前期研究顯示，采用海馬注射Aβ的擬AD大鼠模型以及APPV717I轉基因小鼠模型，三七和梔子有效成分均能夠明顯改善動物的學習記憶能力[1]。在APPV717I轉基因小鼠模型，預防性用藥和早期用藥，三七和梔子有效成分對學習和記憶能力都有很好的改善作用[2]。本研究通過大鼠雙側頸總動脈結扎造成血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)模型，觀察腦復明滴丸對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級SD大鼠60只，按照隨機的原則，分成假手術組、模型組、腦復明高劑量組、腦復明中劑量組、腦復明低劑量組、陽性藥對照組(安理申)，每組10只。術后15 d給藥組動物灌服不同劑量的腦復明滴丸(浸膏)，早晚各1次，共治療30 d；假手術組和模型組給予同等劑量的生理鹽水灌服；陽性對照組灌服安理申。

1.2 模型制作 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)麻醉，固定，頸正中縱行切口，分離雙側頸總動脈，用1號絲線行永久性結扎。假手術組除不結扎雙側頸總動脈外，其他處理同模型組。

1.3 行為學檢測

1.3.1 Morris水迷宮實驗 參照Morris實驗方法進行。大鼠在完成給藥時程后，適應性游泳90 s。具體方法如下：每只大鼠每次測試時間為90 s。測試前先將動物放置在平臺上適應10 s，令其進行空間定位。然后，將大鼠分別從未放置平臺的三個象限輕放入水，并記錄大鼠入水后90 s的運動狀態。將大鼠從入水至找到平臺所需時間定義為逃避潛伏期，記錄大鼠逃避潛伏期及在逃避潛伏期時間內大鼠游泳總路程。若大鼠在規定90 s時間內能夠找到平臺，并在平臺停留超過5 s者視為尋臺成功，其潛伏期則為實際尋臺所用時間；若大鼠在90 s內未能找到平臺，視為尋臺失敗，其潛伏期設定為90 s。此外，如果大鼠90 s內不能找到平合則由實驗者用手牽引大鼠到平臺上停留10 s，再放回到籠中。每只動物測試完一個象限后休息3 h再進行下一次測試。每只動物測試3次/d。前3 d為適應性訓練，第4天進行大鼠逃避潛伏期實驗檢測。每天動物測試順序、入水象限、測試時段保持一致。空間探索實驗：待連續4 d進行定位航行實驗檢測后，于第5天，撤除水池內隱匿平臺，將大鼠從平臺所對象限放入水中，記錄60 s內大鼠在原平臺所在象限的游泳時間(即：目標象限停留時間)。

1.3.2 跳臺實驗 跳臺儀實驗箱為長約120 cm，寬12 cm，高30 cm的有機玻璃箱，共分為6室，每室長12 cm，寬12 cm，高30 cm。實驗箱底面鋪有銅柵，銅柵通過電線與電源相連，電流控制在36 V。實驗箱內銅柵上靠箱內一角置絕緣臺(長徑5.7 cm，短徑4.5 cm，高4.8 cm的五邊形木塊)作為動物回避電擊的安全區。試驗裝置與計算機自動記錄系統相連。實驗時將大鼠放入跳臺儀實驗箱內，適應環境5 min，之后將大鼠輕放于跳臺上，并將銅柵通電，當大鼠從跳臺上跳下四肢接觸銅柵時會受到電擊，正常回避反應是跳上跳臺返回安全區，逃避電擊，如此學習5 min，并記錄此5 min內的觸電次數(錯誤次數)，以此為學習成績。24 h后進行記憶能力測試，將大鼠置于跳臺上，記錄大鼠從停留在跳臺上至第1次跳下受電擊的時間即潛伏期和5 min內的錯誤次數(大鼠四肢同時接觸銅柵觸電的次數)，以此作為記憶功能的評價指標

2 結果

2.1 Morris水迷宮實驗 在定位航行實驗中，模型組大鼠的總路程、以及逃避潛伏期與假手術組比較顯著延長，有統計學意義(P<0.01)，說明腦缺血誘導的癡呆模型大鼠學習記憶能力下降，造模成功。與模型組比較，腦復明滴丸各劑量組以及安理申組逃避潛伏期明顯縮短，有顯著的統計學意義(P<0.01)。與安理申組比較，腦復明各劑量組在逃避潛伏期方面沒有統計學意義(P>0.05)。在總時間方面，與模型組比較，腦復明滴丸各劑量組以及安理申組均能縮短找到平臺的時間，并有顯著統計學意義(P<0.01)。腦復明高、中劑量組的效果優于低劑量組。并且，與安理申組比較，腦復明高、中劑量組潛伏期縮短，有統計學意義(P<0.05)。在空間探索實驗中，與假手術組比較，模型組大鼠在目標象限停留時間顯著縮短，有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，腦復明滴丸高、中劑量組以及安理申組目標象限停留時間延長，并有顯著統計學意義(P<0.01)。腦復明高、中劑量組的效果優于低劑量組。與安理申組比較，腦復明各組大鼠目標象限停留時間無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 腦復明滴丸對血管性癡呆大鼠Morris水迷宮的影響

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.05。

表2 腦復明滴丸對大鼠跳臺實驗的影響

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 跳臺試驗 在跳臺實驗中，與假手術組比較，模型組大鼠潛伏期明顯延長，有顯著的統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，腦復明滴丸各劑量組以及安理申組潛伏期明顯縮短，有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。腦復明各劑量組與安理申組比較沒有統計學意義(P>0.05)。在錯誤次數方面，各組之間沒有統計學意義。見表2。

3 討論

血管性癡呆是由缺血、出血或急慢性腦缺氧等腦血管因素，導致腦組織損害，引起的腦組織血液循環障礙、腦功能減退的一種認知功能缺損綜合征。患者多為慢性、進行性、持續性智能障礙綜合征，臨床表現為記憶及認知等功能障礙綜合征。血管性癡呆已成為繼阿爾茨海默病后的第二大癡呆疾病。隨著人口的老齡化，血管性癡呆發病率逐年上升，嚴重影響患者的生存質量。研究表明，VD是迄今為止唯一可防治的癡呆，如早期治療會具有可逆性[3]。因此探索VD發病的相關因素及發病機制，開發有效的治療藥物，是該領域的研究熱點。

腦復明滴丸是基于中醫“解毒通絡”理論，由三七、梔子有效組分組成的現代化中藥。文獻研究發現，三七皂苷Rg1能通過降低腦組織AchE活性，降低腦組織中脂質過氧化物、脂褐質等的含量，改善記憶損傷模型動物的學習記憶功能[4]。在大腦中動脈栓塞導致的大鼠腦缺血，三七提取物能夠明顯改善大鼠的行為狀態，縮小腦缺血面積[5]。趙雪松等發現，三七總皂苷能夠抑制ICAM-1和TNF-α的釋放，促進腦出血后腦組織病理形態的恢復[6]。研究表明，梔子苷能改善慢性低灌注導致的學習記憶能力受損，具有劑量依賴性，能明顯減輕VD大鼠皮層及海馬的病理變化，有一定的神經保護以及防治癡呆作用[7]。梔子苷對缺血性腦神經損傷中的自由基損傷具有很好的拮抗作用，對缺血性腦神經損傷具有一定的保護作用[8]。梔子粗提物有改善擬癡呆模型鼠學習記憶功能的作用。本文采用的頸總動脈結扎的方法制作大鼠血管性癡呆模型是一種公認的研究癡呆的動物模型[9]。Morris水迷宮實驗包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分。定位航行試驗利用大鼠天性會水但又怕水的特點，迫使大鼠找到隱匿于水下的平臺上岸避水。通過數天反復訓練，使大鼠形成條件反射，能夠運用環境標記判斷水下隱匿平臺的位置，從而形成穩定的空間記憶。檢測指標有逃避潛伏期、游泳總路程以及大鼠在逃避潛伏期內的平均速度等。其中逃避潛伏期是通過記錄大鼠找到水下隱匿平臺時間的長短反映學習能力，是目前較為認可的指標。游泳總路程是大鼠捕捉到水下平臺經過的軌跡，間接衡量其學習能力。空間探索試驗是通過復合型學習，使大鼠形成空間參考記憶。空間探索試驗是在定位航行試驗后去除平臺，在平臺所對象限將大鼠放入水池中，記錄其在規定時間內停留在原平臺所在象限的時間，以此來考察大鼠對原平臺位置的空間記憶能力。通過水迷宮實驗發現，腦復明滴丸可顯著縮短總路程與逃避潛伏期，說明腦復明滴丸對癡呆所致的學習障礙具有一定的改善作用。跳臺試驗是反映動物一次性被動回避，反映記憶功能的試驗。在跳臺實驗中，腦復明滴丸能夠顯著縮短癡呆大鼠的潛伏期，可見治療后大鼠記憶能力已經有所恢復。綜上所述，行為學的結果顯示，腦復明滴丸對血管性癡呆大鼠學習和記憶功能障礙有顯著的改善作用。在后續的研究中，我們將深入探討腦復明滴丸的藥效機制。

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(2014-05-26收稿 責任編輯：張文婷)

Effect of Naofuming Pill on of Learning and Memorizing Abilities of Rats with Vascular Dementia

Du Qinghong, Xu Ya, Li Weinghong, Di Bo, Li Yajie

(PreclinicalMedicalSchool,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To explore the effect of Naofuming pill (NFM) on abilities of learning and memorizing of rats with vascular dementia(VD). Methods: VD model of rats was induced by ligation of bilateral common carotid arteries. Aricept was as used positive control drug. Rats were randomly divided into sham operation group, model group, NFM high dose group, NFM middle dose group, NFM low dose group, as well as positive control group. The ability of learning and memorizing of rats were examined by Morris water maze test and step-down test. Results: In the Morris water maze test, NFM significantly shortened the total distance and the escape latency, and prolonged the residence time in the target quadrant. In the diving platform experiment, compared with model group rats, NFM significantly reduced latency. Conclusion: NFM can improve ability of learning and memoring in rats with VD.

Naofuming pill; Vascular dementia; Learning and memorizing

國家中醫藥管理局中醫基礎理論重點學科及北京中醫藥大學氣化學說與藏象理論研究創新團隊項目(編號:522/0100603001)

杜慶紅，博士，講師，主要研究方向為中藥有效組分配伍的機制研究，E-mail:qhdu2005@126.com

徐雅，博士，副教授，研究方向：中醫藏象理論—心腦臟腑相關理論與實驗研究，E-mail：xuya@bucm.edu.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.019