人參總皂苷對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的大鼠右室肥厚及ERK通路的影響

秦 娜 魏立偉

(河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院，洛陽(yáng)，471000)

人參總皂苷對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的大鼠右室肥厚及ERK通路的影響

秦 娜 魏立偉

(河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院，洛陽(yáng)，471000)

目的:觀察人參總皂苷(Total Ginsenosides，TG)對(duì)野百合堿(Monocrotaline，MCT)所致大鼠右心室肥厚的影響并探討其與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)通路的關(guān)系。方法:雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，MCT模型組，TG 20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)劑量組，各組動(dòng)物均給藥18 d。測(cè)定各組大鼠的右室肥厚指數(shù)(RVHI)、右心重/體重(RVW/BW);透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變;Real time RT-PCR檢測(cè)心肌組織ERK1mRNA的表達(dá)，Western blotting檢測(cè)心肌組MKP-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果:TG預(yù)防給藥均使RVHI、RV/BW表達(dá)明顯降低，改善超微結(jié)構(gòu)損傷，降低心肌組織ERK1mRNA和提高M(jìn)KP-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)論:TG能明顯改善MCT誘導(dǎo)的大鼠右心室肥厚，其抗心肌肥厚作用至少與抑制ERK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

人參總皂苷;右室肥厚;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶;絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1

心肌肥厚是心肌對(duì)多種心血管刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，早期有一定代償意義。但長(zhǎng)期的心肌肥厚將發(fā)展為心力衰竭、心律失常和猝死[1]。右室肥厚、右心力衰竭是肺動(dòng)脈高壓死亡的主要原因[2]。因此，逆轉(zhuǎn)右室肥厚是提高患者生存率和生存質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。

人參主要活性物質(zhì)人參皂苷有阻滯鈣離子通道[3-4]、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖[5-6]、調(diào)節(jié)一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的釋放[7-8]等作用。我們以前的研究表明，人參皂苷Rb1和Rg1能顯著對(duì)抗大鼠心肌肥厚的作用，其機(jī)制可能與抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和絲裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK)信號(hào)通路有關(guān)[9-10]，人參總皂苷的各單體間結(jié)構(gòu)相似，推測(cè)若干成分可能具有類(lèi)似單體的抗心肌肥厚作用，而且人參總皂苷相對(duì)便宜，來(lái)源豐富，更易于開(kāi)發(fā)利用，本研究擬探討人參總皂苷(Total Ginsenosides，TG)對(duì)MCT誘導(dǎo)的大鼠右心室肥厚作用，為傳統(tǒng)中藥人參的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD(Spragye-Dawley)大鼠，清潔級(jí)，體重(200±20) g。由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào):SCXK20020003)。

1.1.2 試劑與材料 TG由北京天然藥物研究院趙銳教授惠贈(zèng)(用JTY-300型反相制備色譜固定相分離，純度>93%)。MCT(批號(hào):106K1602，美國(guó)Sigma公司);ERK1、β-action和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由大連寶生物工程有限公司;SYBR? GREEN PCRMaster Mix(ABI公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司);逆轉(zhuǎn)錄(儀德國(guó)Eppendorf公司)，Model 550型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-Tek公司);Icycler熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MCT模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成正常組對(duì)照、MCT模型組、TG低、中、高劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外其他各組單次腹腔注射(i.p.)2%MCT 60 mg/kg，24 h后TG低、中、高劑量組分別腹腔注射TG 20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)，給藥共18 d。

1.2.2 右室肥厚指數(shù)測(cè)定 稱(chēng)右室(RV)和左室及室間隔(LV+S)的重量，計(jì)算右心肥厚指數(shù)，即RVHI=RV/(LV+S)以及RV/BW。

1.2.3 右心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察 取新鮮右心室組織約1 mm3，電鏡液中固定，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，鈾鉛雙染色，超薄(600A)切片，日立H-600型透射電鏡觀察各組標(biāo)本細(xì)胞核、細(xì)胞器、線粒體等超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.4 Real-Time RT-PCR檢測(cè)心肌組織ERK1mRNA的表達(dá) 右心肌組織總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。以PCR儀逆轉(zhuǎn)錄后，RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。β-actin引物:正向5'-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3'，反向5'-TAGAGCCACCAATCCACACA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度104 bp，ERK1引物正向5'-GTTCCCAAACGCTGACTCCAA-3'，反向5'-GTAAGTCGTCCAGCTCCA

TGTCAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度182 bp，PCR反應(yīng)條件:95 ℃，10 min進(jìn)入循環(huán);95 ℃，15 s、60 ℃，1 min，循環(huán)45次。以β-actin為內(nèi)參，用相對(duì)定量法計(jì)算ERK1 mRNA的表達(dá)水平。以循環(huán)閾值(Ct值)為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，用目的基因表達(dá)/β-actin基因表達(dá)對(duì)ERK1 mRNA進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)心肌組織中MKP-1蛋白表達(dá) 右心室組織約100 mg經(jīng)T-PERTM蛋白提取混合液處理后，取上清液用Bradford蛋白濃度檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。以10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電壓36 V，3 h電轉(zhuǎn)。封閉、分別加MKP-1一抗(1∶400)及內(nèi)參anti-β-actin(1∶2 000)，孵育2 h;二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，孵育1 h后通過(guò)BCIP/NBT進(jìn)行顯色，采用Syngene凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)的變化 正常對(duì)照組在用藥前后一般狀態(tài)無(wú)明顯差異，BW18 d較前增加了36%，MCT模型組大鼠在腹腔注射MCT 7 d出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少，毛發(fā)直立，口唇發(fā)紺，呼吸急促，食欲下降。18 d處死開(kāi)胸，可見(jiàn)肺表面凹凸不平，彈性差，并可見(jiàn)灶性瘀血;BW較前增加了2%，TG各預(yù)防給藥組一般狀態(tài)較MCT模型組明顯好轉(zhuǎn)(見(jiàn)圖1)。

圖1 TG40 mg/kg預(yù)防給藥對(duì)大鼠體重的影響

2.2 TG對(duì)右心室肥厚指數(shù)的影響 與空白對(duì)照組比較，MCT模型組在腹腔注射MCT18 dRVHI、RVW/BW分別增加了30%、44%，TG各預(yù)防給藥組與MCT模型組比較，上述指標(biāo)明顯降低(P<0.01)，但TG各劑量組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見(jiàn)表1)

表1 TG預(yù)防給藥對(duì)野百合堿誘導(dǎo)心肌肥厚大鼠肥厚指標(biāo)的影響

注:與對(duì)照組比較，##P<0.01；與MCT組比較，**P<0.01。

2.3 TG對(duì)心肌肥厚大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 正常大鼠的超微結(jié)構(gòu)無(wú)異常表現(xiàn)(C)，MCT模型組大鼠心肌組織出現(xiàn)閏盤(pán)中斷，肌絲稀疏，灶性溶解，并出現(xiàn)空白水腫，收縮帶形成;線粒體增生，腫脹變形，嵴排列紊亂、溶解，巨線粒體形成;細(xì)胞核增大，核周間隙增寬，核仁增多(M)。TG40、60 mg/(kg·d)預(yù)防給藥18 d上述變化明顯改善，肌絲排列尚可，線粒體輕度肥大，基質(zhì)水腫不明顯，未見(jiàn)閏盤(pán)中斷和空白水腫，但線粒體仍然明顯增生(M〞、H)。(見(jiàn)圖2)

2.4 Real time RT-PCR檢測(cè)ERK1mRNA的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠RV中ERK1mRNA表達(dá)較低。MCT促進(jìn)ERK1mRNA的表達(dá)明顯增加，與正常對(duì)照組比較，ERK1mRNA增加了2.6倍(P<0.01)。TG預(yù)防給藥均明顯抑制ERK1mRNA的表達(dá)，與MCT模型組比較，TG 20 mg/kg使ERK1mRNA的表達(dá)減少29.3%(P<0.01)，各劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見(jiàn)圖3)

圖2 TG預(yù)防給藥對(duì)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖3 TG預(yù)防給藥對(duì)MCT誘導(dǎo)心肌肥厚大鼠RV中ERK1mRNA表達(dá)的影響

2.5 TG預(yù)防給藥對(duì)MCT誘導(dǎo)心肌肥厚大鼠RV中MKP-1蛋白質(zhì)的影響 Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，MCT模型組MKP-1蛋白的表達(dá)稍有增高，TG預(yù)防給藥能使提高M(jìn)KP-1蛋白的表達(dá)，與MCT模型組比較，低、中、高劑量組分別增加了11%、81%、190%，但僅有中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(見(jiàn)圖4、圖5)

3 討論

目前，心肌肥厚發(fā)展為心力衰竭在各種心血管病癥中死亡率占居首位[11]。故對(duì)其預(yù)防和治療的研究顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠MCT右室肥厚模型，觀察了TG對(duì)心肌肥厚的作用并分析其可能的作用機(jī)制。

MCT右室肥厚模型被廣泛用于非原發(fā)于心臟的右心室肥厚和心力衰竭研究[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠在單次腹腔注射MCT 18 d后，RVHI、RVW/BW均明顯高于正常對(duì)照組，說(shuō)明MCT右室肥厚的模型制備成功，TG預(yù)防給藥組能明顯減輕上述指標(biāo)的增高，其中，由于模型組給藥前后BW無(wú)差別甚至略低，與相應(yīng)正常對(duì)照組比較明顯偏輕，RV/BW可能因模型組體重減輕而產(chǎn)生一定的非特異效應(yīng)，但RVHI的明顯升高強(qiáng)烈提示RVH的發(fā)生。單從檢測(cè)指標(biāo)上看，TG高劑量給藥組比低劑量效果更為明顯，然統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，各劑量組間無(wú)明顯差異。另外，心肌組織透射電鏡結(jié)果顯示模型組心肌組織出現(xiàn)了心肌肥厚的病理改變，而TG能明顯改善MCT所引起的心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，提示TG對(duì)右室的心肌線粒體具有保護(hù)作用。以上結(jié)果提示TG具有減輕MCT引起心肌肥厚的作用。

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠右心室MKP-1蛋白質(zhì)表達(dá)

注:A為正常對(duì)照組，B為模型組，C為T(mén)G低劑量組，D為T(mén)G中劑量組，E為T(mén)G高劑量組

圖5 TG對(duì)野百合堿誘導(dǎo)大鼠右心室MKP-1蛋白質(zhì)表達(dá)變化的影響

結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究進(jìn)一步探討了TG預(yù)防心肌肥厚可能的作用機(jī)制。MAPK是調(diào)節(jié)心肌肥厚的重要信號(hào)通路，被認(rèn)為是多種細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞增生、肥大的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的匯聚點(diǎn)或共同通路，MAPK其成員ERKs與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和增殖的調(diào)控關(guān)系最為密切，參與多種刺激引起的心肌肥大[13]。活化的MAPK主要因被其磷酸酶去磷酸化而失活，在心肌細(xì)胞，MKP-1是重要的MAPK磷酸酶，對(duì)MAPK的活性調(diào)節(jié)具有重要意義[14]。另有研究表明，許多人參皂苷單體(Rb1、Rc、Re、Rg1、Rg3)均能降低TPA誘導(dǎo)的ERK1/2的激活，降低ERK1/2蛋白表達(dá)水平[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCT模型組ERK1mRNA水平表達(dá)顯著增高，MKP-1蛋白水平稍有增高，與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TG低、中、高預(yù)防給藥都能降低ERK1mRNA的表達(dá)，同時(shí)提高M(jìn)KP-1蛋白表達(dá)水平，從而增加對(duì)ERK1的滅活，延緩心肌肥厚的發(fā)展進(jìn)程。需要指出的是，TG對(duì)ERK1mRNA表達(dá)的影響各個(gè)劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)MKP-1蛋白水平的影響各個(gè)劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，能劑量依賴(lài)性提高蛋白的表達(dá)，其原因可能是本實(shí)驗(yàn)所用ERK1的引物不是針對(duì)其活性部分的;機(jī)體對(duì)ERK1活性的調(diào)節(jié)發(fā)生在蛋白水平。TG抗心肌肥厚的作用至少與調(diào)控MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜的病理生理過(guò)程，TG抗心肌肥厚的作用除影響MAPK信號(hào)通路外，還可能與其他信號(hào)通路有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

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(2014-04-24收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effects of Total Ginsenosides on Monocrotaline-induced Cardiac Hypertrophy and ERK Signaling Pathway in Rats

Qin Na,Wei Liwei

(LuoyangOrthopedicsTraumatologicalHospital,Luoyang471000,China)

Objective:To investigate the inhibition of total ginsenosides (TG) on right ventricular hypertrophy induced by monocrotaline(MCT) and explore the effects of TG on extracellular-regulated kinase(ERK) signal transduction in rat.Methods:Male Sprague Dawley rats were randomly divided into the normal group,MCT group and 20 mg/(kg·d),40 mg/(kg·d),60 mg/(kg·d) dose TG treatment group.Ventricular hypertrophy index(RVHI) was measured by the weight ratio of RV to left ventricle plus septum,and by observing the ultrastructural changes of myocardial cell with transmission electron microscope.The ERK1 mRNA and mitogen-activated protein kinase phosphatase-1(MKP-1) protein expression of right ventricle tissue were detected by real-time RT-PCR,Western blotting.Results:TG treatment could significantly reduce RVHI,RVW/BW.The swollen and misshapen mitochondria could be improved by TG.TG also could down-regulate ERK1 mRNA expression and enhance MKP-1 protein expression.Conclusion:TG could significantly attenuate MCT-induced cardiac hypertrophy in rat by suppressing ERK Signaling pathway.

Total ginsenosides; Right ventricular hypertrophy; Extracellular-regulated kinase; Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.023