基于藥物體系質量評價模式的柴胡質量表征關聯分析研究

潘 婷 黃亞婷 韓珂卿 孫雅姝 溫 靜 遲 蕾 陳 唯 楊 元 姜艷艷,3 石任兵,3

(1 北京中醫藥大學中藥學院國家中醫藥管理局中藥經典名方有效物質發現重點實驗室，北京，100102；2 首都醫科大學中醫藥學院，北京，100069； 3 北京市教委中藥質量控制技術工程中心，北京，100102)

中藥研究

基于藥物體系質量評價模式的柴胡質量表征關聯分析研究

潘 婷1黃亞婷1韓珂卿1孫雅姝1溫 靜2遲 蕾1陳 唯1楊 元1姜艷艷1,3石任兵1,3

(1 北京中醫藥大學中藥學院國家中醫藥管理局中藥經典名方有效物質發現重點實驗室，北京，100102；2 首都醫科大學中醫藥學院，北京，100069； 3 北京市教委中藥質量控制技術工程中心，北京，100102)

目的：運用藥物體系質量評價模式對柴胡飲片進行質量表征及關聯分析，以有效地評價柴胡飲片的質量。方法：采用HPLC法同時測定柴胡飲片中藥物體系關聯成分蘆丁、柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量，同時表征主要黃酮類成分含量和及主要皂苷類成分含量和，并采用可見分光光度法測定柴胡飲片中總酚類成分含量。結果：基于藥物體系質量評價模式，對柴胡飲片中有效指標性成分含量及其相對比值進行質量表征，同時將不同批次的飲片與經過藥效驗證的基準飲片進行關聯度分析。結果表明，樣品7、8、14中有效指標性成分含量總體高于基準批號5，批號6中有效指標性成分含量與基準批次飲片5相近，樣品7、8、13、14與基準批次飲片5關聯度較高。綜合質量表征及關聯分析結果，樣品7、8、14、5、13的品質居優。結論：基于藥物體系質量評價模式對柴胡飲片的質量進行評價，通過有效指標性成分含量及其相對比值的質量表征，以經過藥效驗證的飲片為基準，結合關聯度分析，可綜合全面地評價柴胡飲片的質量，為柴胡飲片的資源篩選、藥物原料的質量控制和應用提供依據，同時為中藥質量評價提供了方法學及其應用借鑒。

柴胡；關聯分析；主要黃酮類成分和；總酚類成分含量；柴胡皂苷c、a、d；主要皂苷類成分和

柴胡始載于《神農本草經》，列為上品。其為傘形科植物柴胡(BupleurumChinese，DC)或狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld)的干燥根。按性狀不同，分別習稱“北柴胡”和“南柴胡”。具有疏散退熱，疏肝解郁，升陽舉陷的作用，用于感冒發熱、寒熱往來、瘧疾、肝郁氣滯、胸肋脹痛、脫肛、子宮脫落、月經不調[1-2]。現代藥理研究證明柴胡具有解熱、鎮痛、鎮靜、抗炎、免疫增強、保肝利膽、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等作用[3-4]。在2010版《中華人民共和國藥典》中，以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總量之和表征柴胡飲片的質量[5]。隨著對柴胡研究的深入，柴胡中黃酮類成分的研究也受到了人們的關注[6-8]。

在對柴胡飲片的研究中，筆者運用本課題組建立的藥代動力學-藥效動力學-藥物成分相互作用關聯分析方法(PK-PD-DI)研究王永炎院士擬定的臨床經驗方柴金方(柴胡、佩蘭、郁金、肉桂、何首烏)以及組方藥味的抗抑郁藥物體系時，發現柴胡中皂苷類與黃酮類均為其藥物體系的組成成分。中藥化學成分的有效性與其質量性有關，即與中藥化學成分的類型以及存在的量、組成比例等有關[9-11]。

本文報道運用課題組建立的基于藥物體系的中藥質量評價模式[12-14]，對柴胡飲片進行質量評價與控制。以藥物體系為導向，對柴胡中的主要黃酮類、主要皂苷類以及總酚類進行質量表征，建立同時測定黃酮類與皂苷類成分含量的HPLC方法。即在基準批次樣品飲片中檢測到了蘆丁的色譜峰，且發現存在3個與蘆丁紫外光譜圖相似的黃酮類色譜峰，未見文獻報道的槲皮素、異鼠李素、山柰素的色譜峰，故測定蘆丁的含量，并以其為標尺，以基準飲片樣品中標定的4個黃酮類色譜峰為基準，通過主要黃酮類成分峰面積加和表征主要黃酮類成分含量和；同時發現柴胡中皂苷類成分以柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d為主，故測定其含量，并以其含量和表征主要皂苷類成分總含量；并首次建立可見分光光度法測定柴胡中總酚類成分含量的方法。關注有效指標性成分的含量及其和，與組成比例，并與有效性確切的基準飲片進行關聯度分析比較，對柴胡飲片的質量進行綜合考量，以確定其飲片質量優良度，為柴胡飲片的有效應用提供科學依據，亦為有關藥物的質量保障提供支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters X-Bridge C18色譜柱；Waters e2695高效液相色譜儀；Empower Pro軟件系統；2998 PDA檢測器；METTLER-AE240型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TU-1810型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 試藥 蘆丁，(批號：130507純度≥98%)；柴胡皂苷c(批號：131120，純度≥98%)購自成都普菲德生物技術有限公司；柴胡皂苷a(批號：MUST-14031014，純度≥98%)均購自成都曼斯特生物科技有限公司；柴胡皂苷d(批號：130513，純度≥98%)，購自北京方程生物科技有限公司；乙腈(色譜級，Fisher Scientific公司)；甲醇(AR，北京化工廠)；甲酸(AR，北京化學試劑公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；三氯化鐵(分析純)購自天津市申泰化學試劑有限公司；鐵氰化鉀(分析純)購自廣東汕頭市西隴化工廠；十二烷基硫酸鈉(化學純)購自北京化學試劑公司；濃鹽酸(分析純)購自北京化工廠；其余試劑均為分析純。15批柴胡飲片：均購自北京市、福建省廈門市、河南省鄭州市、湖北省武漢市各藥店，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定，均為正品，飲片標本現存于北京中醫藥大學中藥學院中藥化學系。

2 方法與結果

2.1 指標性成分含量測定方法

圖1 210 nm檢測波長下柴胡飲片樣品(A)及標準品(B)HPLC色譜圖

注：1蘆丁；2柴胡皂苷c；3柴胡皂苷a；4柴胡皂苷d

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱，流動相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，洗脫梯度(洗脫梯度：0-5 min，10%～25%A；5-40 min，25%～40% A；40-60 min，40%～55% A)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長分別為360 nm(蘆丁)，210 nm(柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d)。

上述色譜條件下，柴胡對照品及樣品的HPLC譜圖見圖1、圖2，4種已知有效指標性成分及3種未知黃酮類成分在各自的檢測波長下與其他色譜峰分離度良好。

圖2 360 nm檢測波長下柴胡飲片樣品(A)及標準品(B)HPLC色譜圖

注：1蘆丁；5、6、7為3種黃酮類成分；8槲皮素；9異鼠李素；10山柰素

圖1、圖2中1～7號峰各峰保留時間及以柴胡皂苷a為參照時的相對保留時間見表1。

表1 各成分的保留時間及相對保留時間

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取上述4種對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每1 mL含有蘆丁43.6 μg、柴胡皂苷c 273 μg、柴胡皂苷a 450 μg、柴胡皂苷d 324 μg的對照品混合溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱定柴胡飲片粉末(過四號篩)約0.5 g，加甲醇20 mL超聲(功率500 W，頻率40 kHz)提取30 min，濾過，保留濾液，并用10 mL甲醇洗滌容器及殘渣，重復上述操作，提取2次，回收溶劑至干，加甲醇復溶，定容于5 mL容量瓶內，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關系考察 將“2.1.2”項下對照品混合溶液進樣2 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL，以進樣量(mg)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數，結果見表2。

表2 4種成分的回歸方程、相關系數和線性范圍(n=7)

2.1.5 精密度實驗 取“2.1.3”項下同一柴胡樣品溶液，連續進樣6次，測得蘆丁、柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積的RSD分別為2.58%、1.82%、1.93%、2.24%，精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一柴胡飲片樣品，按“2.1.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，測得蘆丁、柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的平均含量分別為0.088 7%、0.055 0%、0.263 0%、0.286 3%，RSD分別為1.90%、1.33%、1.97%、1.61%，重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.1.3”項下同一供試品溶液，于室溫下放置，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣，測得蘆丁、柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的峰面積的RSD分別為1.95%、1.21%、2.46%、2.37%，供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.8 加樣回收率試驗 稱取同一柴胡樣品粉末(過四號篩)約0.25 g，共6份，精密稱定，加入對照品適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，進樣，測得蘆丁、柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的加樣回收率分別為98.65%、97.66%、98.46%、99.87%，RSD分別為2.51%、1.54%、1.09%、1.26%，加樣回收率合格，說明本方法準確、可靠。

2.2 柴胡總酚類成分含量測定方法

2.2.1 供試品溶液的制備方法 精密稱定柴胡飲片粉末(過4號篩)約0.5 g，加甲醇20 mL超聲(功率500 W，頻率40 kHz)提取30 min，濾過，保留濾液，并用10 mL甲醇洗滌容器及殘渣，重復上述操作，提取兩次，回收溶劑至干，加甲醇復溶，定容于5 mL容量瓶內，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備方法 精密稱取一定量的蘆丁標準品3.14 mg，置于10 mL容量瓶內，用70%甲醇定容至10 mL，則標準品的濃度為0.314 mg/mL。

2.2.3 顯色方法 基于課題組前期考察的全方提取物的總酚類成分的測定方法，采用可見分光光度法測定柴胡飲片中總酚類的含量，方法即以蘆丁作為酚類的指標性成分，三氯化鐵-鐵氰化鉀法測定酚類的顯色方法，具體是精密吸取一定量的樣品溶液于25 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇至5 mL，分別加入0.3%十二烷基硫酸鈉溶液1.6 mL及0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1:1)混合溶液2.4 mL，暗處放置7 min，用0.1 mol/L鹽酸加至25 mL刻度線，搖勻后于暗處靜置30 min，于768 nm波長處測定吸光度值[15]。

表3 基于有效指標性成分含量的15個柴胡飲片樣品質量表征(%，n=3)

表4 基于有效指標性成分含量相對比值的15個柴胡飲片樣品質量表征

表5 15個柴胡飲片樣品關聯度表征

2.2.4 線性關系考察 精密吸取2.2.2項下的蘆丁對照品0.030 mL、0.05 mL、0.07 mL、0.09 mL、0.11 mL、0.13 mL，按照2.2.3項下的方法進行顯色。以對照品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸分析，計算回歸方程為：

Y=498.07X+0.095 7，R2=0.998 6(n=6)

結果表明，蘆丁在0.000 376 8 mg/ml～0.001 632 8 mg/mL的濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.2.5 重復性實驗 取同一柴胡飲片樣品，按“2.2.1”項下方法平行制備供試品溶液6份，測得總酚類成分的平均含量為2.26%，RSD 0.96%，重復性良好。

2.2.6 加樣回收實驗 稱取同一柴胡樣品粉末(過四號篩)約0.25 g，共6份，精密稱定，加入蘆丁對照品適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，測定總酚含量，RSD 2.67%，加樣回收率95.55%～101.62%，結果表明該方法加樣回收率合格。

2.3柴胡質量表征

2.3.1 基于有效指標性成分含量的質量表征取 15個柴胡飲片樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，每個平行制備3份，按照“2.1.1”項色譜條件進樣，測定柴胡飲片中蘆丁、柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量，并且以蘆丁為對照品，通過主要黃酮類成分峰面積和表征主要黃酮類成分含量和；柴胡皂苷c、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量加和表征主要皂苷類成分含量和，從而對柴胡飲片中有效指標性成分含量進行全面表征，結果見表3。

2.3.2 基于有效指標性成分含量相對比值的質量表征 以藥物體系中有效指標性成分柴胡皂苷a的含量為基準，將15個柴胡飲片樣品中各有效指標性成分含量與柴胡皂苷a含量的相對比值予以表征，結果見表4。

2.4 柴胡質量表征關聯分析

2.4.1 基于與基準飲片有效指標性成分含量相對比值的質量表征的關聯分析

圖3 15個柴胡飲片樣品中各有效指標性成分含量與基準飲片樣品5對應成分含量相對比值

結合表3和圖3進行分析，可知在15個不同批次的柴胡飲片中，各指標性成分含量的差異較大，并計算最高比值與最低比值的比，以反映各飲片中有效指標性成分含量的差異。蘆丁含量最大比值與最小比值之比為47.95，含量從高到低排序為：14>6>8>5>7>1>3>13>4>2>15>9>11>12>10；主要黃酮類成分含量和最大比值與最小比值之比為15.87，含量從高到低排序為：14>5>6>8>7>1>3>13>4>2>15>9>10>12>11；總酚類成分含量和最大比值與最小比值之比為11.24：10>13>8>14>7>5>11>9>12>1>3>15>6>2>4；柴胡皂苷c含量最大值與最小值之比為6.92，含量從高到低排序為：9>14>2>3>4>1>8>12>7>5>11>15>6>13>10；柴胡皂苷a含量最大值與最小值之比為6.37，含量從高到低排序為：9>14>4>2>12>5>11>8>7>1>3>15>6>13>10；柴胡皂苷d含量最大值與最小值之比為3.5，含量從高到低排序為：9>2>14>4>1>10>12>8>11>7>3>5>6>15>13；皂苷類成分的和含量最大值與最小值之比為4.14，含量從高到低排序為：9>14>2>4>1>12>8>11>7>3>5>10>15>6>13。

分析以上幾個指標性成分含量的差異，蘆丁(47.95倍)>主要黃酮類成分含量和(15.87倍)>總酚類成分含量和(11.24倍)>柴胡皂苷c(6.92倍)>柴胡皂苷a(6.37倍)>主要皂苷類成分含量和(4.14倍)>柴胡皂苷d(3.50倍)。基于蘆丁、主要黃酮類成分含量和、總酚類成分含量、柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、主要皂苷類成分含量和進行綜合考量，發現樣品7、8、14的指標性成分的含量總體上高于基準飲片樣品5，樣品6中有效指標性成分含量與基準飲片樣品5接近。

2.4.2 基于與基準飲片有效指標性成分含量相對比值的比值質量表征的關聯分析

圖4 15個柴胡飲片中各有效指標性成分含量相對比值與基準飲片樣品5對應成分含量對比值的比值

圖4中不同顏色的矩形條代表各飲片中有效指標性成分含量相對比值與基準飲片樣品5對應成分含量相對比值的比值，矩形條大小與基準飲片樣品5中相同顏色的矩形條大小越相近，代表該飲片有效指標性成分含量比值與基準飲片樣品5越接近，即質量表征關聯密切。可以看出，樣品7、8、13、14與基準飲片樣品5質量表征關聯密切。以基準飲片樣品5為基準，其他樣品與其相對比值的比值差值的絕對值之和，即非關聯系數；非關聯系數與有效指標性成分的數目的比值，即非關聯度，進而得到關聯度，以反映飲片質量之間的關聯性，見表5。

由表5可知，關聯度由高到低排序為：5(0/100%)>7(1.0491/85.01%)>8(1.4974/78.61%)>13(1.8788/73.16%)>14(1.9777/71.75%)>15(2.4024/65.68%)>9(2.6183/62.60%)>11(2.6250/62.50%)>12(2.8962/58.63%)>6(2.9577/57.75%)>4(3.1612/54.84%)>3(3.1621/54.83%)>1(3.5829/48.82%)>2(4.6084/34.17%)>10(7.6109/-8.73%)，即樣品7、8、13、14與基準批次飲片的關聯度較高。

3 討論

本文基于藥物體系質量評價模式，對市場上銷售的15個不同批次的柴胡飲片進行質量表征及關聯分析研究，綜合考慮15個不同批次的柴胡飲片與基準飲片樣品5的關聯度以及指標性成分的含量，樣品7、8、14、5、13的品質優良度居前。從以上數據分析看出，柴胡飲片受產地影響比較大，相同產地的飲片各成分在含量上更為接近。

中藥飲片質量與其所含有效化學成分類型及其存在的量、組成比例等因素有關。本文在自然藥學觀相關理論的指導下，基于前期藥物體系組成成分的發現，運用相關中藥質量評價模式，對15個不同批次的柴胡飲片樣品的質量進行表征，并以具有確切藥效的樣品5為基準，進行質量關聯度分析比較，綜合精準評價出柴胡飲片質量的優良度。即綜合考量了柴胡應用有效性及質量關聯性，從而為柴胡資源篩選及其藥物的原料質量控制和應用提供了依據，亦為中藥藥材及其飲片的質量評價提供了研究借鑒。

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(2014-11-25收稿 責任編輯：張文婷)

Quality Representation and Correlation Analysis of Chaihu (Bupleuri Radix) Based on the Quality Evaluation Model of Drug System

Pan Ting1,Huang Yating1,Han Keqing1,Sun Yashu1,Wen Jing1,Chi Lei1,Chen Wei1,Yang Yuan1,Jiang Yanyan1,3,Shi Renbing1,3

(1KeyUnitofExploringEffectiveSubstancesofClassicalandFamousFormulasofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102，China; 2CapitalMedicalUniversitySchoolofTraditionalChineseMedicine，Beijing100069，China; 3MunicipalCommissionofEducationQualityControlTechnologyandEngineeringCenterofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective:To establish quality representation and correlation analysis on Chaihu (Bupleuri Radix) based on the quality evaluation model of drug system.Methods:Use HPLC method to simultaneously determine the 4 effective index components of Chaihu, including rutin, saikosaponin c, a, and d, meanwhile characterize the main contents of flavonoids and saponins. Use visible spectrophotometry to determine the content of total phenolic in Chaihu.Results:Based on the quality evaluation model of drug system to characterize and correlation analysis the effective indicator ingredients and the relative ratio of them. Then evaluate the associate degree of pieces of different batches and the reference piece. The result shows the total content of effective index components in No. 7, No. 8, No. 14 is higher than No. 5 and No. 6 is closer to No. 5. No. 7, No. 8, No. 13 No. 14 have high associate degree with No.5.Comprehensive quality characterization and correlation analysis results, the No.7, No.8, No.14, No.5, No.13 have high quality ranking.Conclusion:Quality representation and correlation analysis of Chaihu are based on a new quality evaluation model of drug system. Considering quality representation based on the content and the content relative ratio of effective index components comprehensively. This paper reports the specific applications of a new way of thinking model for the quality representation and evaluation of Chaihu, providing the foundation of raw material quality control and application screening.

Chaihu (Bupleuri Radix); Correlation analysis; Main flavonoids; Total phenolic ingredients; Saikosaponin c, a, d; Main saponins

十二五國家科技支撐計劃項目(編號：2012BAI29B06)；北京中醫藥大學創新團隊資助項目(編號：2011-CXTD-12)

潘婷(1989—)，女，河南焦作人，在讀碩士研究生，E-mail：pantingbest@163.com

石任兵，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥(復方)有效物質基礎研究與藥物創新，E-mail:shirb@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.027