高效液相色譜法測定土茯苓中落新婦苷、阿魏酸、白藜蘆醇含量

孫兢喆 沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院 (沈陽 110100)

·方藥縱橫·

高效液相色譜法測定土茯苓中落新婦苷、阿魏酸、白藜蘆醇含量

孫兢喆 沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院 (沈陽 110100)

目的：確立土茯苓藥材中阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇三種指標(biāo)成分的含量。方法：應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)測定，色譜條件為ODS-C18色譜柱(5μm，150x4.6mm)，流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液(18：82)，流速1.0mL/min，測定波長290 nm。結(jié)果：阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇分別在0.02088～0.1044 ug、0.4284～2.142 ug、0.0432～0.216ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；樣品中阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇評價(jià)含量分別為0.05964mg/g、0.01455mg/g、0.01839mg/g。結(jié)論：該方法操作簡單、準(zhǔn)確，可作為土茯苓質(zhì)量控制方法。

土茯苓來源是百合科植物光葉菝葜(SmilaxglabraRoxb)的干燥根莖，始載于《名醫(yī)別錄》名禹余糧，《本草綱目》始稱土茯苓。近年來有關(guān)土茯苓對心血管系統(tǒng)、利尿、抗炎、抑菌及解毒等方面藥理作用研究較多[1]；臨床中多用來治療慢性胃炎、急性睪丸炎、滴蟲性陰道炎、梅毒、咳喘、流行性腮腺炎和小兒疳積[2，3]；在成分測定方面，多以落新婦苷或白藜蘆醇為指標(biāo)建立相應(yīng)高效液相色譜法(HPLC)檢測方法[4-9]。我國頒布的藥典中，僅對土茯苓中的落新婦苷進(jìn)行含量測定，并為優(yōu)化土茯苓質(zhì)量評價(jià)的方法，本試驗(yàn)采用HPLC法測定本藥阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥 1.1 儀 器 Agilent 1100高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司)，超聲波提取器(AS3120A，上海)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(GZX-GF40X45，上海)，電子天平(ALC-110.4，上海)。

1.2 試 劑 液相用水為超純水，乙腈、甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇對照品(成都曼思特公司)，液相色譜歸一化法測定三種對照品純度均大于99.0%。土茯苓飲片于2014年2月采購自安徽亳州藥材交易中心，10個(gè)批次的產(chǎn)地分別為：安徽(新興中藥廠)、浙江(黃巖醫(yī)藥藥材有限公司)、江西(雙華中藥飲片廠)、福建(市宏發(fā)中藥材有限公司)、湖南(同仁堂飲片廠)、湖北(協(xié)和堂飲片廠)、廣東(廣印堂飲片廠)、廣西(永剛飲片廠)、四川(方敏飲片廠)、云南(滬譙飲片廠)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王海波教授鑒定為百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件 ODS-C18色譜柱(5μm，150×4.6mm)，柱溫30℃，流動相為乙腈0.05%磷酸水溶液(18：82)，流速1.0mL/min。

2.2 測定波長的確立 經(jīng)參考文獻(xiàn)，并經(jīng)紫外—可見分光光度法測定，綜合三種對照品吸收情況，確定測定波長為290nm。

2.3 溶液制備 對照品制備：精密稱取阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇對照品適量，加甲醇溶解，制成每1mL各含0.1mg、0.2mg、0.1mg的對照品儲備液溶液備用，再按照試驗(yàn)需要加甲醇稀釋至不同濃度。供試品溶液制備：土茯苓藥材粉碎，取粉末1.5g，精密稱定，加70%甲醇適量，加熱回流提取兩次，一次2h、一次1.5h。提取液合并，水浴濃縮至干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解，定量轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4 方法學(xué)考察 2.4.1線性范圍考察：取阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇對照品溶液，分別精密吸取3、6、9、12、15μL溶液，注入液相色譜儀中，測定色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品濃度(mg/L )為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果阿魏酸的回歸方程為y = 2087.2x + 1.77 (r=0.9993)；落新婦苷的回歸方程為y = 85.362x + 58.07(r= 0.9992)、白藜蘆醇的回歸方程為y = 113.57x + 17.49(r= 0.9995)。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn)：取本品1.5g，精密稱定，制成供試品溶液，在4℃低溫保存。精密吸取同一供試品溶液20uL，按2.3項(xiàng)下方法操作，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定色譜峰面積，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=5)分別為1.8% 、2.0% 、3.0% ，表明該方法的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取曬干桑葉供試品溶液分別于0，3，6，12h進(jìn)樣，進(jìn)樣體積20uL，記錄峰面積。阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇含量的RSD分別為2.1% 、2.5% 、2.3% ，表明樣品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)：取土茯苓藥材樣品，分別稱取五份，每份1.5g，精密稱定，按 2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，制備樣品。分別精密吸取20uL，測定阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇含量，RSD(n=5)分別為1.0% 、2.5% 、2.9% ，表明本測定方法的重現(xiàn)性良好。

2.4.5回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取已知準(zhǔn)確含量的本品(阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇含量分別為0.06209mg/g、0.01609mg/g、0.02152mg/g)5份，各0.75g。分別置圓底燒瓶，精密加入阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇對照品適量，按樣品制備方法操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇的回收率分別為101.5%、98.6%、99.60% ，RSD分別為2.9%、2.6%、3.5%。

表1 土茯苓藥材加樣回收率測定結(jié)果

2.5 樣品測定結(jié)果 分別測定10批樣品中阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇含量，含量范圍分別為0.03164～0.08176 mg/g、0.00682～0.02023mg/g、0.01624～0.02618mg/g，平均含量為0.05964mg/g、0.01455mg/g、0.01839mg/g。

3 討 論 本實(shí)驗(yàn)較我國藥典新增了土茯苓阿魏酸和白藜蘆醇的含量檢測，細(xì)化了土茯苓的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)。測定結(jié)果表明阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇的線性范圍分別是0.02088～0.1044μg(r= 0.9993)、0.4284～2.142 μg(r=0.9992)、0.0432～0.216μg(r=0.9995)。方法穩(wěn)定，重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為土茯苓的質(zhì)量控制方法。

本次研究中，分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.025%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.05%磷酸水、以及乙腈-磷酸-三乙胺水溶液等不同組成、不同比例的流動相系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸水溶液組成的流動相系統(tǒng)對樣品溶液中各種組分的分離最好，阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇三個(gè)測定成分與相鄰組分分離度最好。經(jīng)篩選不同比例后確定18：82比例等度洗脫條件即可保證分離效果。

在供試品溶液制備方法考察中，進(jìn)行了提取方法、提取溶劑的比較。回流提取樣品含量高于超聲提取法；提取溶劑考察中，70%甲醇提取效果優(yōu)于甲醇溶劑。

在選定的色譜條件下，供試品溶液中阿魏酸、落新婦苷、白藜蘆醇與相鄰組分分離度良好，陰性液無干擾，經(jīng)方法學(xué)考察，方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率試驗(yàn)均符合有關(guān)規(guī)定。需要注意的是，在穩(wěn)定性試驗(yàn)過程中，樣品保存時(shí)間超過8h，白藜蘆醇成分的含量變化明顯，提示樣品液需要盡快進(jìn)行測定。

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(收稿2014-09-01；修回2014-09-27)

落新婦/分析 阿魏酸/分析 土茯苓 色譜法，高壓液相

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.049