高效液相色譜法測定復方黃芪顆粒中黃芪苷的含量

冒有平 江蘇省如皋市中醫院藥劑科(如皋 226500)

高效液相色譜法測定復方黃芪顆粒中黃芪苷的含量

冒有平 江蘇省如皋市中醫院藥劑科(如皋 226500)

目的：探討高效液相色譜法測定復方黃芪顆粒中黃芪苷的含量。方法：色譜條件：流動相為甲醇-水-乙腈，流速為1mL/min，紫外檢測波長為250nm，進樣量10μL，柱溫35℃。結果：標準曲線方程為Y=013.614X-1.4897，相關系數R=0.9979；本實驗方法精密度符合要求，回收率高，穩定性強，黃芪苷在24h內穩定性良好，高效液相色譜法測定復方黃芪顆粒中黃芪苷的含量為3.39mg/5g。結論：高效液相色譜法測定復方黃芪顆粒中黃芪苷的含量操作簡便迅速，精密度和穩定性均較理想，回收含量高，可為測定中藥中黃芪苷物質含量提供方法依據。

復方黃芪顆粒是臨床上的常用藥，具有健脾益腎，疏肝活血，清熱利濕之功效。黃芪苷是復方黃芪顆粒中主要活性物質之一[1]。黃芪苷具有降壓、鎮驚、鎮痛作用，能增加血漿中cAMP和再生肝DNA的含量[2]；也能促進胰島素的分泌，激活延長小鼠腹腔巨噬細胞的生長，促進炎癥反應的消失[3]。眾所周知，在當前我國藥物的發展進程中，中藥質量標準化的研究是指導臨床合理用藥和保證中藥材質量的主要手段[4-5]。同時我國傳統醫學強調的是中藥的整體效應，對單個成分的作用機制研究較少[6]。由于黃芪苷具有顯著的生物活性，因此高效測量黃芪苷的含量工藝有重要的意義[7]。當前黃芪苷的測定方法有薄層色譜法(TLC)、毛細管電泳法(CZE)等，不過上述方法在含量測定中都普遍存在靈敏度不高、重復性不強的現象[8]。高效液相色譜在當前生物樣品的測定中具有靈敏、快速、分辨率高、重復性好等優點。本文具體探討了高效液相色譜法測定復方黃芪顆粒中黃芪苷的含量價值，現報告如下。

1 材料與方法 1.1 儀器與試劑 復方黃芪顆粒(四川百利藥業有限責任公司，國藥準字Z20003380)，對照品本均來自本實驗組從復方黃芪顆粒中分離得到的黃芪苷，分析純甲醇來自北京化工試劑公司，分析乙腈來自Sigma公司。高效液相色譜(HPLC)選擇Waters 2695，配套有UV waters 2996檢測器，色譜柱為SUNFIRE C18(5μm 4.8×150mm)，KQ-700DB超聲波清洗器來自昆山市超聲儀器有限公司，FTIR-8400S型紅外光譜儀與GSP-84-02型磁力恒溫攪拌器都來自島津公司。

1.2 色譜條件 流動相：甲醇-水-乙腈；流速：1mL/min；紫外檢測波長：250nm；進樣量：10μL；柱溫：35℃。黃芪苷純品HPLC色譜圖見圖1。

圖1 黃芪苷純品HPLC色譜圖

1.3 對照品的制備 精密稱取黃芪苷標準品20mg，分別精確配成0.4mg/mL、0.8mg/mL，1.2 mg/mL，1.6 mg/mL，2.0 mg/mL的溶液，搖勻，分別經0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

1.4 供試品的制備 取復方黃芪顆粒200g，分別用1500mL甲醇浸泡過夜回流提取，分離得到復方黃芪顆粒粗提物5g，甲醇溶解，選擇二氯甲烷甲醇10：1(200 mL)和4：1(400 mL)洗脫，提取后溶于50mL甲醇作為黃芪苷的供試品。

1.5 標準曲線的制作 分別精密吸取0.15 mL，0.30 mL，0.45 mL，0.60 mL標準品溶液，各加入無水乙醇定容至0.75 mL，置于冰浴中加入7.5 mL體積分數為72%的硫酸搖勻，在30min內，于波長250nm處測定吸光度，所求得標準曲線方程為Y=013.614X-1.4897，相關系數R=0.9979，線性范圍為10.2-102μg/ mL-1，表明線性回歸較好。

2 結 果 2.1 精密度試驗 取已配好的對照品黃芪苷溶液重復進樣6次，進樣量為5μL，記錄各峰面積，計算RSD值分別為1.6%、1.7%、1.8%、1.6%，1.1%和1.7%，表明本實驗方法精密度符合要求。

2.2 穩定性實驗 取復方黃芪顆粒的粗提物溶解，在0、4、12、24h測定，進樣量為5μL，測得蒙古黃芪的黃芪苷RSD值為0.263%、0.265%，0.263%，0.266%，結果表明黃芪苷在24h內穩定性良好。

2.3 加樣回收率 在加樣回收率實驗中，我們取復方黃芪顆粒粗提物2.00g，分別加入黃芪苷0mg、0.50mg、1.00mg，甲醇溶解過濾，母液上硅膠柱色譜，分選擇二氯甲烷甲醇10：1(200 mL)和4：1(400 mL)洗脫，然后繼續進行微孔過濾，進樣量為5μL。各個實驗重復3次，取峰面積的平均值，結果見表1，表明其回收率高，穩定性強。

表1 黃芪苷的加樣回收率

2.4 樣品含量 我們選擇復方黃芪顆粒的供試品溶液進樣10μL測定黃芪苷的含量，結果顯示黃芪含量為3.39mg/5g。見表2。

表2 復方黃芪顆粒的黃芪苷含量

3 討 論 黃芪是豆科黃芪屬植物，祖國醫學認為黃芪性甘，微溫，歸肺，脾經，具有斂瘡生肌、利尿托毒、補氣固表之功效[9]。在具體的藥學機制上，黃芪對正常機體的抗體生成功能有明顯促進作用。黃芪作為常用的抗衰老中藥，可顯著提高老年大鼠的血漿皮質醇含量[10]。黃芪合劑具有明顯的抗疲勞作用，能增強心肌收縮力，改善心臟功能。復方黃芪顆粒是當前在臨床上應用的一種常見藥物，該藥的功能主治為益氣、活血、熄風、通絡。并且劑型攜帶、服用方便，當前應用有較高的抗乙肝病毒活性?，F代研究表明研究發現復方黃芪顆粒中含有的黃芪苷等化合物具有較強的生物活性，具有正性肌力作用及缺血性腦損傷保護作用及抗炎作用。

色譜法是近代發展起來的一種物理及物理化學的分離分析方法，其藥物化學成分分析的色譜方法包括薄層色譜、高效液相色譜、高速逆流色譜氣相色譜、超臨界流體色譜等。

本文采用高效液相色測定了復方黃芪顆粒中黃芪苷的含量，結果顯示色譜回歸曲線為Y=013.614X-1.4897，相關系數R=0.9979，線性范圍為10.2-102μg/ mL-1，表明線性回較好。同時分析結果表現本實驗方法精密度符合要求，黃芪苷在24h內穩定性良好，為復方黃芪顆粒中黃芪苷的含量評價提供了一定的依據。

當前隨著分離提取、結構鑒定技術的發展，復方黃芪顆粒已經分離了多種三萜皂苷類化合物，顯示其化學成分復雜，對于有效物質的提取與色譜分析要求更高[9]。我們在色譜分析中，建立的體系為流動相：甲醇-水-乙腈；流速：1mL/min；紫外檢測波長：250nm；進樣量：10μL；柱溫：35℃。結果顯示其回收率高，穩定性強，黃芪含量為3.39mg/5g。同時復方黃芪顆粒中生物活性成分多樣，單一活性成分的含量不能夠反應黃芪的生物活性的全貌，還需要我們在下一部工作中進行多活性組分含量測定，使充分發揮其藥用價值，具有重要意義[11]。

[1] 楊 莉.復方黃芪顆粒聯合拉米夫定治療慢性乙型病毒性肝炎臨床研究[J].中醫學報，2013，28(4)：579-580.

[2] 韋尉元，吳 琨，王曉通，等.Cdx2-RNA基因沉默轉染胃癌MGC-803細胞對中藥人參黃芪復方藥物敏感性的影響[J].廣東醫學，2013，34(7)：994-998.

[3] Huang X， Tang L， Wang F， et al. Astragaloside IV attenuates allergic inflammation by regulation Th1/Th2 cytokine and enhancement CD4+CD25+Foxp3 T cells in ovalbumin-induced asthma[J].Immunobiology，2014，219(7)：565-571.

[4] 張 彤，黃順旺.HPLC-ELSD測定前列舒樂顆粒中黃芪甲苷[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(7)：118-120.

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[6] Si YC， Li Q， Xie CE， et al. Chinese herbs and their active ingredients for activating xue (blood) promote the proliferation and differentiation of neural stem cells and mesenchymal stem cells[J].Chin Med，2014，9(1)：13-14.

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(收稿2014-08-16；修回2014-09-21)

黃芪苷/分析 色譜法，高壓液相 @復方黃芪顆粒

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.051