柴胡防治乙型肝炎的網絡分子機理初探*

沈 霞 張 崗 陳 瑩 陜西中醫學院藥學院 (西安 712046)

柴胡防治乙型肝炎的網絡分子機理初探*

沈 霞 張 崗 陳 瑩 陜西中醫學院藥學院 (西安 712046)

目的：乙型肝炎是危害我國人民健康的最主要疾病之一，中藥柴胡防治乙肝療效顯著，然而其分子機理尚不清楚。本研究通過計算機輔助技術闡明柴胡防治乙型肝炎的分子機理及其作用靶點。方法：本研究通過數據庫搜索得到乙肝病毒的靶點，在TCMSP數據庫中篩選靶點與化合物，在PDB數據庫中查詢靶點的三維結構，利用Auto Dock軟件對靶點和小分子進行對接打分，并通過Cytoscape軟件構建網絡模型。結果：研究發現Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase靶點與柴胡中Dextrin Corn和GLB之間存在明顯的相互作用；通過有效成分與靶點網絡模型的構建闡明了柴胡有效成分防治乙肝的多成分對應對靶點的分子網絡機制。結論：本研究揭示柴胡防治乙肝的物質基礎、潛在靶點及分子網絡機理，為研究開發中藥防治乙肝新藥提供理論基礎。

乙型肝炎是危害我國人民健康的多發疾病之一，是由乙型肝炎病毒引起的疾病。感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)可引起肝炎、肝硬化甚至肝癌。我國是HBV感染的高發區，約有1.2億HBV攜帶者，其中2000多萬人為慢性乙肝患者。根據衛生部《2013中國衛生統計年鑒》統計，2012年我國病毒性肝炎發病數就達138.08萬人，占法定甲、乙類傳染病的第1位，排在病毒感染性疾病的首位，排在疾病死亡的第4位。HBV感染不僅給患者及其家庭造成巨大的經濟和精神負擔，而且給國家帶來巨大壓力。因此，開發研制新的特異性防治HBV的藥物對我國具有重要的社會和經濟效益。

傳統中藥防治肝病歷來有之。柴胡為我國傳統中藥, 藥用歷史悠久。柴胡(Radix Bupleuri)為傘形科(Umbelliferae) 柴胡屬( Bupleurum L.) 植物，始載于《神農本草經》，列為上品。屬解表類中藥，具有治療肝郁氣滯，疏肝解郁、升舉陽氣等作用[1]。在臨床上柴胡及其復方一直用于肝病的預防和治療[2]。然而，柴胡防治肝病的分子機制一直沒有進行深入的研究。基于此，本研究以系統藥理學的理論和方法為指導[3]，用乙肝病毒的蛋白靶點對柴胡中的主要有效成分進行虛擬篩選，并構建柴胡小分子與靶點的互作網絡圖。期望揭示柴胡防治乙肝的物質基礎、潛在靶點及多成分多靶點的分子網絡機制，為研究開發中藥防治乙肝新藥提供理論基礎。

1 實驗部分 1.1 數據的準備 從Drug bank數據庫中搜索hepatitis B乙肝病毒的靶點。在TCMSP[4]數據庫中搜索相應的柴胡化學成分。通過篩選，最終得到4個蛋白靶點：Chymotrypsinogen B(2CHA)、DNA gyrase subunit B(4GFN)、RAC-alphaserine/threonine-protein kinase(3096)。篩選得到的小分子化合物主要有：槲皮素、葛根素、糊精、月桂酸和莰非醇12種等。在PDB和NCBI中下載乙肝靶點的Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase(1X9D)三維結構和柴胡化合物結構。

1.2 分子對接 采用Auto dock軟件對柴胡中化合物分子去除水分子加上氫，接著處理Ligand，為其加上電荷，設置Root和可扭轉的鍵。 參數采用默認值，遺傳算法使用拉馬克遺傳法，可以通過軟件將相應靶點分子和化合物構象載入窗口觀察到對接情況，分析聚類構象，在receptor環境中可以觀察對接構象并得出對接分值。

1.3網絡模型的構建 將數據導入Cytoscape，建立網絡結構。并分別用不同顏色表示靶點和化合物，本文中以深色圓點表示靶點，以淺色圓點表示化合物。

2 結果與討論 利用篩選得到的4個靶點對柴胡中的12個化合進行虛擬篩選，最終發現靶點Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase和柴胡中的Dextrin Corn、GLB分子對接結果最為合理，靶點與分子間的結合能Binding Energy分別為-3.96和-6.64。對接圖中表明(圖1左)，Dextrin Corn分子距離靶點中的氨基酸殘基GLU283、SER282、GLU273、LYS275、LYS655、TRP284較近。在Dextrin Corn分子周圍有許多己電離的極性氨基酸殘基，這些殘基與Dextrin Corn分子之間所形成的靜電作用對復合物的穩定起重要作用。同樣(圖1右)，GLB與靶蛋白氨基酸殘基ARG334、ARG597、GLU599、PHE649、GLU689、THR688、PRO598距小分子較近。在GLB分子周圍有許多己電離的極性氨基酸殘基，這些殘基與GLB分子之間所形成的靜電作用對復合物的穩定起重要作用。這一研究首次找到并證實了柴胡小分子防治乙肝的主要作用靶點。

圖1 柴胡中Dextrin Corn、GLB與靶點Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase對接示意圖

將篩選所得4個靶蛋白與12個柴胡化合物導入Cytoscape構建的網絡模型如圖2所示：其中深色的為蛋白質靶點，淺色的為化合物。臨床中廣泛利用小柴胡湯治療慢性乙型肝炎, 表明小柴胡湯聯合抗病毒藥物治療慢性乙肝具有改善肝功能和清除血清標志物的作用[5-6]。從圖中可以看出柴胡12種化學成分與4種蛋白質靶點形成了復雜的網絡關系，從分子角度展示柴胡防治乙肝的多成分對應多靶點的網絡機制。此外，與靶蛋白RAC-alphaserine/threonine-protein kinase(3096)發生作用的化合物種類最多。表明在柴胡防治乙肝病毒中，這一靶點是柴胡作用的主要靶點。

圖2 柴胡多成分多靶點的分子網絡模型

3 結 論 中藥多成分-多靶點的作用模式一直是中藥研究的熱點和難點。本論文用計算機軟件研究乙肝作用靶點與柴胡有效成分的相互作用，從理論上篩選與乙肝靶點有互作的柴胡有效成分，首次闡明了柴胡防治乙肝的物質基礎及對應靶點。本研究構建網絡模型展示柴胡防治乙肝多成分多靶點的作用關系。柴胡化學成分復雜多樣，通過分子網絡模型可以很好的闡釋其在治療乙肝的過程中的復合效應。不同成分作用于同一個靶點時其效果可能會疊加，也可能會相互抵消，這有待于進一步的實驗考證。本文通過計算機模擬實驗對靶點和藥物成分進行篩選，構建網絡模型闡明柴胡在治療乙肝的物質基礎、潛在的靶點及分子網絡，為闡明中藥復雜的作用機制提供技術方法，同時為開發中藥防治乙肝新藥提供理論基礎。

[1] 中華人民共和國衛生部藥典編輯委員會.中華人民共和國藥典[M]． 北京: 人民衛生出版社，2010: 263．

[2] 楊 柳,王雪瑩.北柴胡化學成分與藥理作用的研究進展[J].中醫藥信息,2012,29(3):143-145.

[3] 王永華,楊 凌.基于系統藥理學的現代中藥研究體系[J].世界中醫藥,2013,8(7):801-809.

[4] 汝錦龍，李 鵬，汪紀楠，等 ．TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines ：Journal of Cheminformatics ，2014 Apr 16 ：6(1):13.

[5] 黃幼異,黃 偉,孫 蓉.柴胡皂苷對肝臟的藥理毒理作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2011,17(17)：789-791.

[6] 陳丹丹,龔作炯.小柴胡湯治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床研究 [J]. 現代中西醫結合雜志， 2011 ，20(31)：384-386.

(收稿2014-07-08;修回2014-08-09)

*陜西省科技廳自然科學基金(2014JQ4148)

肝炎，乙型/中醫藥療法 柴胡/治療應用 分子機理

R512.62

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.054