澤丹沖劑對盆腔炎性大鼠子宮TGF-β1、Smad3的影響研究*

谷 風 陶紅星 沈祖泓 曾遠強 羅彩萍 張敏玲 苗久旺

廣州中醫(yī)藥大學附屬清遠中醫(yī)院(清遠 511500)

澤丹沖劑對盆腔炎性大鼠子宮TGF-β1、Smad3的影響研究*

谷 風 陶紅星△沈祖泓 曾遠強 羅彩萍 張敏玲 苗久旺▲

廣州中醫(yī)藥大學附屬清遠中醫(yī)院(清遠 511500)

目的：研究澤丹沖劑對慢性盆腔炎大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3表達的影響，闡明以利濕化瘀法為主的澤丹沖劑作用機制。方法：大鼠雙側(cè)宮腔內(nèi)注射大腸桿菌混懸液(濃度約為6×106)0.2mL建立慢性盆腔炎大鼠模型。造模成功后，隨機分成澤丹沖劑高、中(8g·kg、4g·kg)劑量組，婦樂顆粒組(2.5 g·kg)，模型組和正常組。灌胃給藥21d后，采用Western Blot法檢測大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3表達。結果：與模型組比較，澤中、高劑量組，婦樂組子宮組織TGF-β1、Smad3表達均明顯降低(P<0.05)，但澤中、高劑量組優(yōu)于婦樂組(P<0.05)。結論：澤丹沖劑通過降低TGF-β1、Smad3的異常高表達，減輕慢性盆腔炎大鼠子宮組織的纖維化及粘連，因而對慢性盆腔炎具有良好的治療作用。

慢性盆腔炎易反復發(fā)作，遷延致包塊形成、不孕、月經(jīng)不調(diào)等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。前期的臨床研究及部分實驗研究表明[2-5]，以利濕化瘀法為的澤丹沖劑可調(diào)節(jié)慢性盆腔炎患者血清-CRP、SOD、MDA等異常表達，具有良好的臨床療效及抗組織氧化、改善局部血液循環(huán)等作用，因此，本研究旨在前期基礎上，進一步探討澤丹沖劑對慢性盆腔炎大鼠模型治療作用的影響，以期為臨床研究及新藥的開發(fā)研制進一步提供更多的、更深層次的實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料 SD雌性大鼠55只、SPF級，體重(200±20)g，購自廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心 [許可證號SYKK(粵)2008-0092]。澤丹沖劑由澤瀉、桃仁、丹參、當歸等組成，上述藥物按處方量投料，加10倍水煎煮，每次3h，共2次，煎煮液合并后，濃縮、真空干燥，得干浸膏備用(由清遠市中醫(yī)院制劑室提供)；婦樂顆粒(江西南昌濟生制藥廠生產(chǎn)，每袋6g)，用蒸餾水配成0.13mg/mL混懸液，40C下保存，使用時充分搖勻[6]。

1.2 方 法

1.2.1 造模方法：用濃度為10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3mL/100g)，無菌條件下取大鼠下腹正中切口約0.8～1.0cm，暴露子宮，用4號針頭分別向雙側(cè)宮腔內(nèi)注射大腸桿菌混懸液(濃度約為6×106)0.2mL，注畢，分層關腹，消毒術區(qū)，正常喂養(yǎng)[6]。

1.2.2 分組及處理：SD雌性大鼠55只適應性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法抽取10只為正常組，其余45只造模后隨機分為模型組(15只、其中隨機抽取5只做模型驗證)、澤丹沖劑高劑量組(澤高組)(10只)、澤丹沖劑中劑量組(澤中組)(10只)、婦樂顆粒組(婦樂組)(10只)。造模成功后，第8d開始灌胃給藥，藥物劑量按照人與動物公斤體重的等效劑量比值進行折算給藥[7]。澤高組、澤中組予澤丹沖劑(8g·kg、4g·kg)，婦樂組予婦樂顆粒混懸液(2.5 g·kg)，正常組和模型組予等體積生理鹽水，1d1次 ，連續(xù) 21d[5]。

1.2.3 指標檢測：給藥后第22d早上禁食，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠子宮組織，采用Western blot法檢測子宮組織TGF-β1、Smad3的表達。

1.2.4 病理判定標準[8-9]：無炎性細胞浸潤，為0分(+)；內(nèi)膜中見少量炎性細胞浸潤，為1分(++)；內(nèi)膜中見大量炎性細胞浸潤，且腺上皮輕度增生、極性排列規(guī)則，為2分(+++)。采用雙盲法，每張切片由兩位病理醫(yī)師分別記分。

2 結 果

2.1 各組大鼠子宮組織病理變化 2.1.1大體觀察：正常組：子宮大小、形態(tài)正常，漿膜無明顯充血及水腫，與盆腔周圍組織無粘連；模型組：子宮明顯腫脹、粘膜充血及水腫，多數(shù)宮腔迂曲腫脹，末端球狀膨大，切面管壁變薄，管腔內(nèi)可見清亮液體；澤高組：子宮無明顯充血，與盆腔組織粘連明顯減輕，少數(shù)有輕度積液；澤中組：子宮腫脹、充血基本消失，無積液，與盆腔周圍組織粘連顯著減輕；婦樂組：子宮炎性充血部分消失，與周圍組織輕度粘連，子宮形態(tài)部分恢復正常[6]。

2.1.2子宮組織HE染色病理評分：與模型組比較，澤中、高組，婦樂組子宮組織病理評分均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中澤中組具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示澤中、高組均能減輕大鼠子宮內(nèi)膜炎癥細胞浸潤，減輕充血及腫脹[6](見表1)。

表1 慢性盆腔炎大鼠子宮組織形態(tài)學的改變

注：與模型組相比，△P<0.05，▲P<0.01

2.1.3 各組大鼠子宮組織含TGF-β1、Smad3的表達(見表2)。

表2 各組大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3的表達結果±s)

注：與模型組比較，△P<0.05；與澤中組比較，◇P<0.05

結果顯示：模型組TGF-β1表達顯著高于其它各組(P<0.05)；澤中組與正常組比較，無顯著性差異(P>0.05)；婦樂組與澤高組比較，無顯著性差異(P>0.05)；與澤中組比較，有顯著性差異(P<0.05)。

結果顯示：模型組Smad3表達顯著高于其它各組(P<0.05)；澤中組與正常組含量相當，無顯著性差異(P>0.05)；婦樂組低于澤高組，但無顯著性差異(P>0.05)；澤高組明顯高于澤中組，有差異(P<0.05)。

3 討 論 慢性盆腔炎易導致盆腔粘連或輸卵管阻塞，對女性生殖健康造成嚴重影響。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)及其信號通路分子Smad3在調(diào)控膠原代謝的細胞因子網(wǎng)絡失衡中，具有非常重要的作用[10]，TGF-β1的促纖維化作用可能主要通過Smad3途徑誘導結締組織生長因子(CTGF)表達來完成[11]。

研究表明，TGF-β是調(diào)節(jié)組織炎癥和修復的重要細胞因子。適量TGF-β1經(jīng)局部或靜脈給予，能夠促進因糖皮質(zhì)激素影響等原因難以愈合的傷口正常愈合[12]。而組織慢性損傷后修復過度的一種病理結局就是纖維化的形成。雖然TGF-β1在正常組織受損后修復中，具有非常重要的作用，但其合成與降解失衡或過多會導致組織纖維化。大鼠實驗表明，連續(xù)被注射TGF-β1可導致腎、肝等器官及注射部位組織纖維化的發(fā)生。此外， TGF-β1的持續(xù)合成釋放使ECM進行性沉積，從而致組織纖維化和瘢痕的形成[13-14]。而TGF-β1是目前已知的對膠原合成最直接和有效的刺激劑，其激活TGF-β/Smad信號傳導通路，主要是通過與其靶細胞(主要是成纖維細胞)上的受體結合而使膠原過度沉積導致纖維化的發(fā)生發(fā)展[15]。

Smads 蛋白是 TGF-β 下游信號轉(zhuǎn)導和調(diào)節(jié)分子，磷酸化的 Smad2 和 Smad3 與Smad4 形成 Co-Smads 入核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，從而誘導纖維化改變[16]。而Smad3是TGF-β和激活素(Activin)信號轉(zhuǎn)導通路中共同的關鍵信號蛋白[17]。特異性阻斷Smad3蛋白表達，有可能同時解除 TGF-β和激活素的作用，起到高效抗肝纖維化作用。

以利濕化瘀為主的澤丹沖劑中蒲公英為君藥，具有消散癰腫、清熱解毒之功效；輔以敗醬草，因其苦辛涼微寒而清熱祛瘀、解毒止痛、排膿消腫；車前子、澤瀉能淡滲利濕、化瘀止痛；丹參善調(diào)婦女經(jīng)脈而具有活血祛瘀之功效；三棱、莪術乃破血行氣之品；與丹參相伍治瘀滯腹痛；延胡索行氣活血、化瘀止痛；柴胡配香附疏肝止痛、理氣調(diào)經(jīng)[15]。實驗研究結果表明：與模型組比較，各治療組大鼠子宮組織中的TGF-β1、Smad3表達明顯降低，說明澤丹沖劑及婦樂顆粒均可有效地降低TGF-β1、Smad3的異常表達，但澤丹高、中劑量組療效優(yōu)于婦樂組(P<0.05)。

[1] 豐有吉，沈 鏗.婦產(chǎn)科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：276-277.

[2] 谷 風.從濕瘀論治慢性盆腔炎30例[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，29(11)：1464-1465.

[3] 谷 風，劉建美.利濕化瘀法治療慢性盆腔炎的療效觀察[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2007，23(1)：51-52.

[4] 谷 風，嚴 英，陶紅星．利濕化瘀中藥對慢性盆腔炎血液流變學及血清C-反應蛋白的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(5)：1102-1105.

[5] 谷 風.利濕化瘀法對慢性盆腔炎大鼠血清SOD、MDA影響的實驗研究[J].陜西中醫(yī)，2010，31(4)：496-497.

[6] 谷 風，陶紅星，苗久旺，等.澤丹沖劑對盆腔炎性大鼠子宮TGF-β1mRNA、CTGFmRNA的干預研究[J].陜西中醫(yī)，2014，35(5)：623-625.

[7] 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學實驗動物學[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：332-335.

[8] Wada A，Tada Y，Kawaamura K，et al.Influence of Fasl on influammtion and tumor survival are dependent on its expression levels[J].Cancer Gene Ther，2007，14(3)：262-267.

[9] Guo Z，Zhang M，Tang H，et al.Fas signal links innate and adaptive immunity by promoting dendritic-cell sccrition of CC and CXC chemokines[J].Blood，2005，106：2033-2041.

[10] Xaubet A，Marin-Arguedas A，Lario S，et al.Transforming growth factor betalgene polymorphisms are associated with disease progress in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am Jrepie Crit Care Med，2003，168：410.

[11] Fan WH，Pech M，Karnovsy MJ.Conective tissuegrowth factor(CTGF)s imulate vascular smoothmuscelecell growth and migration in vitro[J].Eur Jcell Biol，2000，79(12)：915-923.

[12] Beck LS，DeGuzman L，Lee WP，et al.One syetemic adminis-tration of transforming growth factor -beta 1 reverses age or glucocorticoid impaired wound heanling[J].J Clin Invest，1993，92(6)：2841-2849.

[13] Terrell TG，Working PK，Chow CP，et al.Pathology of recom-binant human transforming growth factor-beta 1 in rats and rabbits[J].Int Rev Exp Pathol，1993，34(Pt B)：43-67.

[14] Zugmaier G，Paik S，Wilding G，et al.Transforming growth factor beta 1 induces cachexia and systemic fibrosis without an anti-tumor effect in nude mice[J].Cancer Res，1991，51(13)：3590-4.

[15] 谷 風.利濕化瘀法對慢性盆腔炎大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3mRNA影響的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(12)：3242-3243.

[16] 靳慧斌，李智偉.轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad 信號通路及其在肝纖維化中的作用研究進展 [J].山西醫(yī)藥雜志，2009，38(1)：37-40．

[17] Jones CP，Gregory LG，Causton B，et al. Activin A and TGF-β promote T(H)9 cell-mediated pulmonary allergic pathology[J].J Allergy Clin Immunol，2012，129(4)：1000-1003.

(收稿2014-09-29；修回2014-10-17)

Effects of Zedan infusion on Smad3 and TGF-β1 in rats with chronic pelvic inflammatory disease

Qingyuan Hospital of TCM Affiliated to Guangzhou University of TCM(Qingyuan 511500)

Gu Feng Tao Hongxing Shen Zuhong et al

Objective: To observe the effects of Zedan Infusion on Smad3 and TGF-β1 in the rats with Chronic pelvic inflammatory disease ,so as to discuss its mechanism.Methods: The rat model of chronic pelvic inflammatory disease was established by injecting coli suspension (concentration of about 6×106) 0.2ml to the bilateral intrauterine.After the modeling,the rats were randomly divided into Zedan Infusion high and medium (8g·kg, 4g·kg) dose group, Fule particle group (2.5g·kg), model group and the normal group.After oral administration 21d, the expression of TGF-β1 and Smad3 was assayed by the Western Blot. Results :Compared with the model group,the expression of TGF-β1 and Smad3 was significantly lower (P<0.05), which was better in Zedan infusion high and medium dose group than in Fule group (P<0.05).Conclusion: Zedan infusion can reduce the abnormal expressions of TGF-β1 and Smad3，has anti-tissue adhesions and fibrosis effects，thus it has good clinical efficacy on Chronic pelvic inflammatory disease．

Pelvic Inflammatory Disease/traditional Chinese medicine therapy Animal experimentation Rats @Zedan infusion

*廣東省清遠市科技局博士項目(2013A012)

盆腔炎性疾病/中醫(yī)藥療法 動物實驗 大鼠 @澤丹沖劑

R711.33

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.057

△深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院(深圳 518000)

▲山東中醫(yī)藥高等專科學校(煙臺 265200)