電針足三里對AD小鼠大腦皮層APP和Aβ表達的影響*

李 翀 韓燕燕 樊小農

天津中醫藥大學(天津300193)

電針足三里對AD小鼠大腦皮層APP和Aβ表達的影響*

李 翀?韓燕燕?樊小農▲

天津中醫藥大學(天津300193)

目的:探究電針足三里對老年癡呆小鼠大腦皮層β-淀粉樣肽前體蛋白(APP)及β-淀粉樣肽蛋白(Aβ)表達的影響。方法: 將快速老化小鼠SAMP8隨機分為模型組、電針組和非穴組，并設同源SAMR1小鼠作為對照組。電針組給予足三里電針干預，非穴組針刺雙側固定非穴位點。應用免疫組織化學SABC法觀察各組小鼠大腦皮層APP及Aβ的表達情況。結果:SAMP8大腦皮層內APP和Aβ蛋白呈較高表達的狀態，電針治療后明顯下調，與模型組、非穴組相比，差異有統計學意義(P<0.01)；而非穴組與模型組相比，各指標差異無統計學意義(P>0.05)。結論:電針足三里能有效改善AD，其機制可能與其下調AD小鼠大腦皮層APP及Aβ蛋白水平的表達有關。

阿爾茲海默病(AD)即老年性癡呆，統計資料顯示我國目前有老年性癡呆患者約500萬，到2020年患病人數將超過600萬，并以每年三四十萬人的數量增長，給家庭和社會帶來沉重的負擔和危害[1-3]。現代醫學對其尚缺乏理想的治療手段，而中醫針灸卻有其獨到之處。

目前有關針灸治療阿爾茲海默病的研究雖然取得了可觀的進展，但針灸是如何對AD發揮其治療作用的，尚未達成共識。多項研究表明：電針多個穴位對AD有較好的療效[4-6]，但其最佳組方目前尚不統一。療效可靠、作用機制明確的單穴位針灸治療AD鮮見報道。本研究選取快速老化小鼠SAMP8為研究對象，以SAMR1小鼠為對照，觀察電針足三里對SAMP8鼠大腦皮層β-淀粉樣肽前體蛋白APP及Aβ表達水平的影響，以探討電針足三里延緩AD進程的可能作用機制。

1 實驗材料 雄性快速老化小鼠亞系(Senescence-accelerated mouse prone/8，SAMP8)，6月齡，清潔級，共18只。健康同月齡抗快速老化小鼠亞系(Senescence-accelerated mouse resistancel/1，SAMR1)，清潔級，共6只。所有小鼠均由天津中醫藥大學第一附屬醫院動物中心提供。

APP及Aβ兔抗大鼠一抗試劑盒、SABC山羊抗兔二抗試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉試劑有限公司)； 圖像分析系統(同濟醫科大學千屏影像工程公司)。

2 實驗方法 2.1 分 組 將18只SAMP8小鼠隨機分為3組：模型組、電針組和非穴組，每組6只。同源SAMR1小鼠6只，作為對照組，飼養條件完全相同。

2.2 針刺方法 取穴:根據華興邦《大鼠穴位圖譜的研制》[7]，足三里穴定位于小腿前外側，當犢鼻下三寸，距脛骨前緣一橫指處。非穴位點定位于季肋部，髂嵴上方約3 mm處。針刺操作:電針組：束縛小鼠，左側足三里穴處垂直進針，進針深度5mm，連接電針治療儀，疏密波，電流強度3mA，電針頻率4～30 Hz，刺激10 min 。非穴組：同樣方法針刺雙側固定非穴位點。模型組和對照組：不實施任何針刺。

每日固定同一時間點針刺1次，第7、14d全部動物休息1d，干預療程共21d。各組小鼠每天以同樣力度、同樣方式，于同樣時間進行抓取、固定。

2.3 觀察指標及方法 各組治療結束處死動物后，取其腦組織，放入4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、連續切片。按照免疫組化試劑盒說明書進行染色并檢測，每組切片隨機觀察12個視野后，精確選取其視野內所有陽性顆粒，采用圖像分析系統檢測陽性顆粒的總面積、面積百分比和積分光度，并對檢測結果進行定量分析。

3 實驗結果 3.1 各組小鼠大腦皮層區APP蛋白水平表達比較 光鏡下，APP蛋白表達的陽性信號定位于細胞漿內，呈棕黃色顆粒。對照組APP陽性細胞少，散在分布，胞體小，染色淡；模型組與非穴組表現為胞體肥大，染色增強，且數量增多，與對照組相比，陽性物質總面積、百分比及積分光度均增加，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；電針組APP陽性細胞散在分布，與模型組及非穴組比較，胞體變小，數量減少，染色減弱，陽性物質總面積、百分比及積分光度均降低，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。非穴組與模型組相比，各指標差異無統計學意義(P>0.05，P>0.05，P>0.05)。結果見圖1、表1。

表1 各組小鼠大腦皮層區APP蛋白表達情況

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05； 與非穴組比較，◇P<0.05

3.2 各組小鼠大腦皮層區Aβ蛋白水平表達比較 Aβ陽性細胞呈棕黃色。模型組與對照組相比：胞體增大，突起增粗，表達增加，陽性物質總面積、百分比及積分光度均增加，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；電針組與模型組、非穴組相比，各指標均降低，差異具有統計學意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；非穴組與模型組相比，各指標差異無統計學意義(P>0.05，P>0.05，P>0.05)。結果見圖2、表2。

表2 各組小鼠大腦皮層區Aβ蛋白表達情況

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05； 與非穴組比較，◇P<0.05

A：對照組 B：模型組 C：電針組 D：非穴組

A：對照組 B：模型組 C：電針組 D：非穴組

4 討 論 AD是一種神經系統退行性疾病，以進行性記憶減退和認知障礙為主要臨床特征。β-淀粉樣肽蛋白(Aβ)聚集形成老年斑(SP)為其主要病理特征[8-9]。而Aβ由β淀粉樣前體蛋白(APP)水解產生，任何影響APP水解的因素，均可導致Aβ的沉積，從而引起腦部神經元的凋亡、壞死及淀粉樣變，此為老年斑形成的始動因子及構成老年斑的核心組分，進而激活膠質細胞，產生神經毒性。

快速老化小鼠SAMP8既有學習記憶缺陷的快速衰老特性，又有淀粉樣變性增加、老年斑等AD的重要特征，是目前較為理想的衰老模型[10]。本實驗試圖通過降低SAMP8小鼠APP和Aβ的表達來抑制老年斑的形成，降低激活神經膠質細胞的數量，以達到保護神經細胞的作用，從而探究延緩AD進程的作用機理。

國內外有關治療老年性癡呆的方法目前大多數仍處于臨床實驗階段，且長期服用一些西藥極易引起嚴重的肝腎損傷[11]。針灸療法作為祖國醫學的重要部分，副作用極少，故而，本實驗探究電針對AD小鼠老化關鍵性蛋白APP與Aβ表達影響，為電針治療AD的臨床選穴提供參考。祖國醫學認為AD系老年腎精虧虛、痰凝血瘀所致。足三里為“足陽明胃經”的主要穴位之一，是一身中重要的強壯大穴。傳統中醫認為，按摩或針灸足三里可以調理脾胃、補中益氣、通經活絡、疏風化濕。研究還發現針刺足三里能使微血管新生，從而增加腦微循環血流量，改善腦組織供氧[12]。Zhu sx等也報道電針百會、太西、足三里可以降低激活的神經膠質細胞的數量，從而保護神經元，改善AD大鼠的學習記憶能力[13]；張雪竹等研究發現針刺膻中、血海、足三里等穴位能改善腦細胞病理形態，從而提高老年癡呆小鼠的學習記憶能力，改善其認知功能[14]。因此本實驗選取“足三里”為其治療用穴。

實驗以SAMR1小鼠為對照，觀察電針足三里對SAMP8小鼠大腦皮層β-淀粉樣肽前體蛋白APP及Aβ表達水平的影響，結果顯示：SAMP8模型組小鼠大腦皮層內APP和Aβ蛋白呈較高表達的狀態，電針治療后明顯下調，表現為胞體明顯變小，染色強度減弱，數量減少，陽性物質總面積、百分比及積分光度均降低，差異有統計學意義；而電針組APP和Aβ蛋白的表達較SAMR1對照組仍高，差異有統計學意義。提示電針足三里可明顯降低APP及Aβ的蛋白表達水平，可在一定程度上改善AD；并且實驗還發現電針組和非穴組相比，APP和Aβ蛋白的表達均降低，差異有統計學意義，提示電針足三里較其他部位療效可靠、作用明確，具有穴位特異性。

綜上所述，電針足三里可能通過下調AD小鼠大腦皮層APP及Aβ蛋白的表達水平，從而抑制老年斑的形成，降低激活神經膠質細胞的數量，達到保護神經細胞的作用，延緩AD進程。但是電針足三里治療AD的途徑復雜多樣，減少APP水解產生Aβ可能僅是途徑之一。此實驗只選用了單個穴位，為了更好的為臨床服務，仍需要配穴組方進一步驗證，從選取最佳組方的角度來探討針灸延緩AD進程的作用機理。

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(收稿2014-11-29;修回2015-01-13)

Effects of electro-acupuncture at “Zusanli” on the expressions of APP and Aβ in the cortex of Alzheimer's disease mice

Tianjin College of Traditional Chinese Medicine(Tianjin 300193)

Li Chong Han Yanyan Fan Xiaonong

Objective:To investigate the expressing levels of APP and Aβ proteins owing to the influence of electro-acupuncture at “Zusanli” in Seneseenee accelerated mice (SAMP8) brain.Methods: The Seneseenee accelerated mice (SAMP8) were randomLy divided into 3 groups: model group, anelectro-acupuncture group, and sham-acupuncture group. The SAMR1 was used as control. The expressing levels of APP and Aβ proteins were evaluated by immunohistochemical assays.Results: The expressing levels of APP and Aβ proteins in the cortex of Seneseenee accelerated mice were high. They were both reduced by electro-acupuncture compared with model group or sham-acupuncture group. The differences were statistically significant(P<0.01，P<0.01). Meanwhile, there were no statistically significant difference between the various indicators in sham-acupuncture group(P>0.05，P>0.05).Conclusion: Alzheimer's disease could be treated effectively by Electro-acupuncture at “Zusanli”. The mechanism was possibly related to the down-regulated expressing levels of APP and Aβ proteins in the cortex of SAMP8.

Alzheimer disease/acupuncture-moxibustion Electroacupuncture Point ST36 Ainmal experimentation Mice

* 天津市高等學校科技發展基金項目(20090206)

阿爾茨海默病/針灸療法 電針 穴,足三里 動物實驗 小鼠

R749

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.05.049

?天津中醫藥大學第一附屬醫院病理科(天津300193)

▲天津市針灸研究所(天津300193)