參麥注射液聯合化療對結直腸癌Lovo細胞的增殖抑制作用*

李 俊

上海梅山醫院腫瘤科 (南京210001)

參麥注射液聯合化療對結直腸癌Lovo細胞的增殖抑制作用*

李 俊

上海梅山醫院腫瘤科 (南京210001)

目的：探討參麥注射液在腫瘤抗血管生成作用的時間窗問題，即最佳用藥時間。方法：建立荷瘤小鼠模型，觀察參麥注射液聯合草酸鉑/氟尿嘧啶抑制腫瘤增殖作用并觀察荷瘤小鼠生存期的影響。結果：參麥聯合化療對人腸癌LOVO細胞及HUVEC的增值抑制作用最明顯，效果高于相同劑量化學藥物或單藥參麥注射液。動物實驗結果表明，先給予參麥注射液后給予奧沙利鉑對腸癌Lovo荷瘤裸鼠皮下移植瘤的抑制作用最大，瘤體體積及重量最小，對腫瘤細胞的殺傷作用最為明顯，癌細胞體積減少明顯。結論：化療前給藥可能是參麥注射液的抗血管生成最佳治療時間，確切機制仍需進一步探討研究。

結直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，有逐年上升的趨勢[1]。中醫藥以其獨特的優勢在大腸癌的治療中發揮了不可替代的作用，其在抗腫瘤新生血管生成的作用受到人們的廣泛關注[2]。參麥近年來研究有一定的抗血管生成作用，參麥注射液聯合化療藥物使用時可起到協同抗血管生成作用，能起到更好的抑制腫瘤細胞的效果[3]。

本研究通過體外細胞培養技術和動物實驗進一步闡明參麥注射液的抑制腫瘤血管生成作用和化療協同作用。建立荷瘤小鼠模型，觀察參麥注射液聯合草酸鉑/氟尿嘧啶抑制腫瘤增殖作用并觀察荷瘤小鼠生存期的影響；體外培養人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，觀察參麥注射液抑制血管內皮增殖作用；觀察參麥注射液增加上述化療藥物對腸癌細胞系的抑制作用。采用參麥注射液協同化療藥物對體外培養的小鼠腸癌細胞的協同增敏制作用，探討參麥注射液在腫瘤抗血管生成作用的時間窗問題，即最佳用藥時間。

1 實驗選材與實驗方法 1.1 實驗選用動物、細胞及實驗試劑 BALB/ c 裸鼠共計30只，約6～7 周齡，體重介于16～21g，要求均為雌性，購自生物技術公司，飼養于SPF環境。人腸癌Lovo細胞購自南京凱基生物技術公司，HUVEC細胞為本實驗室自建，培養于RPMI1640培養基，培養基中含10 %新生牛血清，養護條件為37℃、5 %CO2孵箱。奧沙利鉑(江蘇恒瑞公司)；參麥注射液(正大青春寶公司)；RPMI1640培養基(Gibco BRL) 、新生牛血清(杭州四季青公司) 、四甲基偶氮唑藍(MTT ,Sigma) 、二甲基亞砜(DMSO ,Sigma) 。

1.2 人腸癌Lovo細胞的復蘇與培養 取凍存的人腸癌LoVo細胞，復蘇后培養于由RPMI1640培養液中，放置于37℃,5%CO2培養箱中，細胞每2d更換新鮮培養液。

1.3 MTT法檢測單純奧沙利鉑(以下用OXA代替) 參麥聯合OXA對人腸癌LoVo細胞和HUVEC細胞的殺傷活性。

1.3.1 取對數生長期的人腸癌LoVo細胞，采用PBS液配置濃度為1×106/mL細胞懸液，接種于多孔板中，孔板選用180uL/孔，96孔；分別配置不同濃度的化療藥和參麥注射液濃度，設生理鹽水對照組，每組選定3個復孔，置于培養箱中培養48h(培養箱為37℃、5%CO2)，加入MTT 10uL，同樣條件繼續培養4h，棄上清，加入DMSO100uL。采用酶標儀選用570nm波長測各孔的吸光度A值，以此計算細胞存活率，采用公式為：存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%，繪制濃度效應曲線，將藥物濃度定為橫軸，存活率定為縱軸，確定半數抑制(IC50)濃度。

1.3.2 常規分離培養HUVEC,在含VEGF、B-FGF的EDMM內皮細胞條件培養液培養；加入梯度濃度的參麥注射液、OXA誘導，設生理鹽水對照組，每組選定3個復孔，置于培養箱中培養48h(培養箱為37℃、5%CO2)，加入MTT 10uL，同樣條件繼續培養4h，取出棄上清，加入DMSO100uL。采用酶標儀選用570nm波長測各孔的吸光度A值，以此計算細胞存活率，采用公式為：存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%，繪制濃度效應曲線，將藥物濃度定為橫軸，存活率定為縱軸，確定半數抑制(IC50)濃度。

1.4 動物實驗體內抑制腫瘤作用 將處于對數生長期的人腸癌Lovo細胞注射于BALB/c裸鼠的右側后肢根部皮下，數量為2×10^6/mL個，體積均為0.1mL/只。2周后選擇荷瘤大小近似的裸鼠共計15只，隨即分為生理鹽水(對照組)、OXA組，參麥聯合OXA組，每組各5只。OXA組腹腔內注射1mg/kg的奧沙利鉑0.2mL/只，隔日1次，共3次；參麥聯合OXA組，先給予參麥注射液，0.2mL/只，隔日1次，共3次，再給予奧沙利鉑0.2mL/只，隔日1次，共3次；NS組腹腔內注射生理鹽水，同樣為0.2mL/只，隔日1次，共3次。從治療開始每兩天用游標卡尺測量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b)，計算腫瘤體積=0.5×a×b2，觀察腫瘤的生長狀況。治療后第15d采用頸椎脫臼法處死所有實驗動物，取下移植瘤，測量各瘤重，分別計算各組荷瘤鼠的瘤重抑瘤率(TWI)，公式為：TWI%=(1-治療組平均瘤重/生理鹽水對照組平均瘤重)×100%，將瘤體組織置于4%甲醛溶液中固定，送IHC。

1.5 微血管濃度計算 瘤組織石蠟切片采用SP法染色，操作步驟按試劑盒要求，滴加羊抗小鼠CD31單抗，以PBS代替一抗作對照，HRP標記的兔抗羊多克隆抗體作為二抗，采用標準IHC檢測流程，以已知陽性的切片作陽性對照。CD31標記微血管，計數腫瘤內著色的毛細血管和微小血管。

2 結 果 2.1 參麥注射液聯合奧沙利鉑及奧沙利鉑單藥對人腸癌Lovo細胞的抑制活性的比較 由表1可以看出，參麥注射液和奧沙利鉑對人腸癌Lovo細胞的增值都有抑制作用，但是與單藥相比，聯合參麥注射液后對腸癌細胞的抑制率增加，加入參麥注射液后能明顯提高奧沙利鉑對腸癌Lovo細胞的殺傷作用，效果更明顯。

表1 參麥注射液和奧沙利鉑對Lovo細胞的抑制活性

2.2 參麥注射液聯合化療對腸癌裸鼠移植瘤的抑制作用 由表1可見，先給予參麥再給予化療藥物對腸癌荷瘤裸鼠的抑制作用最大，腫瘤生長延緩，體積較小，奧沙利鉑組其次，參麥和化療藥同步及先用化療藥后用參麥效果相差無幾。從表2可以看出，參麥及奧沙利鉑對于荷瘤裸鼠都有抑瘤作用，而先參麥后給予化療藥物的遺留作用明顯強于兩者單藥或者其他聯合用藥方式，瘤重抑瘤率差異效果顯著(P<0.05)。參麥聯合化療與對照組相比差異有極為顯著(P<0.01)。病理觀察結果顯示，采用參麥聯合化療治療組中的淋巴細胞浸潤、中性粒細胞、腫瘤細胞壞死程度均明顯高于對照組，癌細胞團體積，血管反應則明顯少于對照組(見圖1)。

表2 奧沙利鉑、參麥及兩者聯用對荷瘤裸鼠的抑瘤作用

Lovo細胞在對照組的生長狀況，HE×100(A)和HE×400(B),聯合組(參麥+奧沙利鉑)，更多的組織壞死和淋巴浸潤，

3 結 論 參麥注射液組方源于《千金要方》之生脈散，是“生脈散”衍變方，具有益氣養陰之功效，參麥是人參和麥冬組成的復方。目前參麥注射液的抗血管生成作用的實驗研究層出不窮，但對參麥注射液的使用時間問題的研究幾乎沒有。本文通過對荷瘤裸鼠模型的抑瘤作用，研究在化療的不同時間段應用參麥，通過對裸鼠的抑瘤情況及瘤體大小的觀察，尋找參麥注射液抗血管生成的最佳治療時間。本實驗研究體外結果表明，參麥聯合化療對人腸癌Lovo細胞及HUVEC的殺傷作用活性最強，明顯高于同等劑量化療藥物或單純用參麥注射液對細胞的殺傷活動。動物實驗結果表明，先給予參麥注射液后給予奧沙利鉑對腸癌Lovo荷瘤裸鼠皮下移植瘤的抑制作用最大，瘤體體積及重量最小，對腫瘤細胞的增值抑制作用最強，且腫瘤細胞的體積減少最明顯，壞死癌細胞量大，癌細胞周圍的炎細胞浸潤明顯。本研究表明給予化療與參麥注射液聯合，可增強抑制腫瘤細胞的能力，聯合用藥后抑制腫瘤細胞作用增強，起到協同作用，比單給予參麥注射液或化療效果更強，且先給予參麥后給予化療效果最佳，可能是參麥注射液的最佳抗血管生成時間。

化學藥物治療成為抑制腫瘤細胞的主要手段之一，化學藥物在抑制腫瘤細胞生長的同時對機體免疫系統造成嚴重的損傷[4]。在治療腫瘤的過程中，對于腫瘤細胞的殺傷作用及對機體免疫功能的保護具有相同的重要性，因此，我們致力于尋找一種既能增強機體的免疫功能及增強化療療效，又能減少化學治療帶來的毒副作用的藥物。本研究通過對參麥注射液聯合化療對荷瘤裸鼠的增值已抑制作用，探討參麥注射液在腫瘤抗血管生成作用以及對化療藥物的增敏作用。研究結果表明參麥注射液化療前用藥可以顯著提高療效，提高患者生活質量及總生存期。化療前給藥可能是參麥注射液的抗血管生成最佳治療時間，確切機制仍需進一步探討和研究。

[1] 蔣益蘭,荊 珍. 中醫藥防治大腸癌轉移作用和機制的研究概況[J]. 湖南中醫雜志, 2009, 25(1)：1376-1379.

[2] 王 程,楊運高,王學良. 活血化瘀經典方劑對小鼠大腸癌肝轉移模型端粒酶及p53、cerbB-2、Bcl - 2 基因表達的影響[J]. 第一軍醫大學學報, 2005, 24(7)：758-760.

[3] 錢曉萍,劉寶瑞,胡 靜,等. 參麥注射液聯合環磷酰胺抑制血管生成作用的實驗研究[J]. 現代腫瘤醫學, 2006, 14(11)：1344-1347.

[4] Zhang L, Yu D, Hicklin DJ, et al. Combined anti2fetal liver kinase 1 monoclonal antibody and continuous low2dose Doxorubicin inhibits angiogenesis and growth of human soft tissue sarcoma xenografts by induction of endothelial cell apop tosis[J]. Cancer Res,2012, 62: 2034-2042.

(收稿2015-01-20;修回2015-02-11)

Shen Mai injection combined with chemotherapy in colorectal cancer Lovo cell inhibition

Department of Oncology, Shanghai Meishan Hospital

(Nanjing 210001) Li Jun

Objective: To investigate the SMI was anti-angiogenic effect in tumor time window problem that optimal treatment time. Methods: The tumor-bearing mice were observed Shenmai injection combined with oxaliplatin / fluorouracil inhibit tumor proliferation and survival of tumor-bearing mice outlook affect period. Results: shenmai combination chemotherapy cytotoxicity in human colon cancer cells and HUVEC Lovo most active, significantly higher than the SMI was measured at the same chemotherapy drugs or simply using. Animal experiments show that SMI was first given after the administration of oxaliplatin Lovo cancer tumor-bearing nude mice maximum inhibition, tumor volume and minimum weight, tumor cell killing effect is most obvious, cancer cell volume decrease significantly. Conclusion: The administration of chemotherapy may be shenmai injection of anti-angiogenic best treatment time, the exact mechanism needs further discussion and study.

Colorectal neoplasms/traditional Chinese medicine therapy Shen Mai Zhu She ye/therapeutic uses

* 南京市醫藥衛生科研項目(YKK10210)

結直腸腫瘤/中醫藥療法 參麥注射液/治療應用

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.05.050