硝菔通結方對便秘大鼠血清5-HT和結腸組織AQP3的影響*

滿思藝 謝 培 王郁金 周永學

陜西中醫學院 (咸陽712046)

·實驗研究·

硝菔通結方對便秘大鼠血清5-HT和結腸組織AQP3的影響*

滿思藝 謝 培 王郁金 周永學△

陜西中醫學院 (咸陽712046)

目的：觀察硝菔通結方對便秘模型大鼠血清5-HT和結腸組織AQP3表達的影響，揭示該方治療便秘的作用機制。方法：將50只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、硝菔通結方低、中、高劑量組。除正常組外，其余各組大鼠以15mg/kg復方地芬諾酯混懸液灌胃28 d，復制便秘模型。模型成功后，分別給藥21d，后取血清和結腸組織，ELISA法檢測血清5-HT含量，Q-PCR法檢測結腸組織AQP3的mRNA表達。結果：模型組的大鼠血清中5-HT含量與正常組比較明顯升高(P<0.05)；藥物治療后，各治療組血清中5-HT含量均降低(P<0.05)，其中硝菔通結方高劑量組最為顯著(P<0.01)；模型組結腸組織中AQP3與正常組比較表達升高(P<0.05)，各劑量的硝菔通結方治療組均降低了結腸組織中AQP3的表達，其中硝菔通結方高劑量組最為明顯(P<0.05)。結論：硝菔通結方可通過降低血清5-HT含量和降低結腸組織AQP3的表達從而促進腸道動力和調節腸道水液代謝，對功能性便秘發揮治療作用。

功能性便秘是以排便次數減少、糞便量減少、糞便干結、排便費力等為表現的臨床常見病，并且隨著年齡增加，便秘的發生率和嚴重程度也會隨之增加[1]。便秘已成為嚴重影響現代人生活質量的疾病嚴，并且易誘發結腸癌、心腦血管意外等疾病[2]。硝菔通結方是在清代著名醫家張錫純所創名方“硝菔通結湯”的基礎上，根據功能性便秘常以腎虛為主的特點，加入了助陽通便的肉蓯蓉和潤腸通便的當歸。全方由芒硝、萊菔、肉蓯蓉、當歸組成，用于治療腎虛腸燥型便秘臨床療效確切，但該方的作用機制目前尚不十分清楚。而現代研究表明，功能性便秘的發生于腸道動力失常和水液代謝紊亂密切相關，而腸神經遞質5羥色胺(5-HT)和水通道蛋白3(AQP3)與腸道動力和水液代謝密切相關[3-5]。因此本實驗通過觀察硝菔通結方對功能性便秘大鼠體內5-HT及AQP3的影響，為該方的臨床應用提供依據。

1 材料與方法 1.1 動物 選用成年雄性SD大鼠50只，體重200～250g，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心，合格證號：SCXK(陜)2012-003。適應性飼養一周后進行實驗，自由攝食及飲水。

1.2 主要試劑和儀器 大鼠5-HT Elisa檢測試劑盒：批號：23007331；上海西唐生物技術有限公司； EasyPure RNA Kit：批號：ER101-01H30716Q046，北京全式金生物技術有限公司；cDNA合成試劑盒、Q-PCR試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司; AQP3引物的設計與合成：南京金斯瑞生物科技有限公司；PCR儀EDC-810型：北京東勝創新生物科技有限公司；核酸測定儀，型號：NANODROP2000C，Thermo(美國)公司；高速分散器(內切式勻漿機)，XHF-D；寧波新芝生物科技股份有限公司；全自動高壓滅菌器：5Y0915，日本三洋公司；酶標儀：ELX808， Bio Tek，美國伯騰儀器有限公司；低溫4℃離心機：上海第三儀器廠。

1.3 分組與造模 采用隨機數字法將大鼠隨機分為正常組、功能性便秘(FC)模型組、硝菔通結方低劑量組、硝菔通結方中劑量組、硝菔通結方高劑量組，每組10只。除正常組外的各組大鼠每日灌服復方地芬諾酯溶液，灌服濃度為15mg/kg，連續灌胃28d后，大鼠出現排便困難，被毛脫落，喜扎堆等現象，表示功能性便秘(FC)模型制造成功。正常組以等量生理鹽水灌胃。

1.4 藥物治療 對硝菔通結方低、中、高3個劑量組每日分別灌服95g/kg、190g/kg、380g/kg的硝菔通結方；正常組和FC組每日灌服2mL/100g的生理鹽水。

1.5 樣本的采集與檢測 給藥21d后，實驗動物禁食24h，10%的水合氯醛 4mL/kg腹腔注射麻醉，開腹腔腹主靜脈采血3～10mL，室溫靜置血液30min后離心分離出血清，按試劑盒說明書用雙抗體兩步夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中5-HT的濃度；取回盲部以下結腸組織1cm，用預冷的生理鹽水清洗，置于5mLEP管中，加入1mL RNAhold，勻漿，按RNA提取試劑盒提取總RNA，取2 μL總RNA按照反轉錄試劑盒合成cDNA，cDNA合成體系：總RNA2μL，ALL-in-one SuperMix4μL、gDNA Remover1μL,加RNase-free Water定容至20μL，輕輕混勻，42℃孵育15min，85℃加熱5min，測定cDNA，備用。Q-PCR法檢測mRNA表達，PCR反應體系：PCR Mix 10μL，引物各0.4μL，cDNA量根據濃度定，加滅菌蒸餾水補足至20μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 S；57℃退火45S；72℃延伸40S；共40-45個循環72℃終末延伸10 min。引物序列見表1。

表1 Q-PCR引物序列

2 結 果 2.1 一般情況 正常組大鼠行動活躍、精神良好、皮毛光澤,實驗后體重、食量隨增齡明顯高于實驗前；模型組大鼠大便困難(便量少，便粒小，糞便干結，無光澤)，形體消瘦，喜扎堆，被毛脫落，納差，造模后體重增加不明顯；治療組(硝菔通結方低、中、高劑量組)大鼠在治療后，體重均有增加，精神狀態及排便情況出現明顯好轉，扎堆現象消失，造模時脫落的被毛重新長出。

2.2 硝菔通結方對功能性便秘大鼠血清5-HT含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清5-HT含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，硝菔通結方高、中、低劑量大鼠血清5-HT濃度明顯降低(P<0.05)，其中以高劑量組最為明顯(P<0.01)，見表2。

表2 硝菔通結方對功能性便秘大鼠血清中5-HT含量的影響

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05，◇P<0.01

2.3 硝菔通結方對功能性便秘大鼠結腸組織AQP3表達的影響 與正常組比較，模型組結腸組織中AQP3表達較正常組有顯著性升高(P<0.05)；硝菔通結方各劑量可有效降低結腸組織中AQP3的表達, 其中高劑量組與模型組具有顯著性(P<0.05)差異,見表3。

表3 大鼠結腸組織AQP3的表達

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

討 論 5-HT是腸神經系統中一種重要的單胺類神經遞質，由嗜鉻細胞(enterochromaffin cells, EC)通過色氨酸羥化酶1(tryptophan hydroxylase 1，Tph-1)合成，具有促進腸蠕動和分泌的作用。5-HT釋放并作用于靶細胞發揮作用后，必須重吸收至細胞內降解、滅活，終止其作用，該過程即由5-HT轉運體(serotonin transporter, SERT)完成。因此，5-HT對胃腸道運動功能的調節需要5-HT、5-HT受體、SERT的共同參與才能完成[6]。研究發現[7,8]便秘患者的結腸黏膜5-HT陽性細胞數量和染色強度均以及TpH1的轉錄明顯增加，但EC細胞的數量及SERT轉錄水平卻無改變，因此推斷黏膜內5-HT的合成和釋放增加，可能是由于其受體敏感性和反應性下降，從而導致便秘[9]。本實驗中便秘模型大鼠血清中5-HT含量明顯高于正常組，經過硝菔通結方治療后，5-HT含量下降至正常值，提示硝菔通結方通過改善5-HT的受體敏感性和反應性從而恢復腸神經系統對胃腸道調節的作用。

AQP3屬跨膜蛋白家族，主要分布于人類小腸和結腸的上皮細胞中，其所介導的自由水快速被動的跨生物膜轉運是水進出細胞的主要途徑，在消化道上皮細胞對水的吸收中起重要作用[10]。AQP3具體的作用機制尚不十分清楚，但臨床研究發現功能性便秘患者右半結腸AQP3含量顯著高于對照組[11]，且應用瀉藥后，結腸中AQP3的表達顯著降低[5][12]。這些結果都提示AQP3可能通過將糞便中的水分轉運至結腸上皮細胞，從而降低糞便含水量。AQP3表達升高引起糞便含水量降低，繼而引發便秘，這可能是便秘發生的一個重要機制。本實驗中便秘模型大鼠腸組織中AQP3表達顯著升高，經過硝菔通結方治療，大鼠結腸組織中AQP3表達降低，提示硝菔通結方通過降低AQP3從而調節腸道對水分的吸收，對功能性便秘發揮治療作用。

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(收稿2014-11-10；修回2014-11-25)

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陜西醫學、陜西中醫雜志社

Effects of Xiaofu Tongjie Prescription on the 5-HT content in Serum and the Expression of AQP3in Colon in Constipated Rats

ShaanXi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Man Siyi Xie Pei Wang Yujin et al

Objective:To observe the effect of Xiaofu Tongjie prescription effect on the 5-HT content in serum and the mRNA expression of AQP3in colon in constipated rats, so as to reveal the mechanism of the prescription in the treatment of constipation. Methods: 50 male SD rats were randomly divided into normal control group, model group, Xiaofu Tongjie-low dose group, Xiaofu Tongjie-medium dose group and Xiaofutongjie-high dose group. Except the normal control group, the rest of the rats were intragastrically administered with 15mg/kg compound diphenoxylate for 28 days to replicate the constipation model. Then serum and colonic tissue samples were collected after 21 days of treatment. The 5-HT content in serum were detected with ELISA method and the mRNA expression of AQP3were detected with Q-PCR method.Results: The 5-HT content in serum of the model group increased significantly compared with the normal control group(P<0.05). After prescription treatment, the 5-HT level in each treatment group decreased (P<0.05),and the Xiaofu Tongjie-high dose group marked decreases (P<0.01). AQP3expression in colonic tissue of model group increases compared with the common control group (P<0.05), different dose of the Xiaofutongjie prescription groups all decrease the AQP3expression in colonic tissue, but Xiaofu Tongjie-high dose group marked ecreasesP<0.05).Conclusion:Xiaofutongjie prescription can reduce the 5-HT content in serum and decrease the mRNA expression of AQP3in colon, thus to improve the intestinal power and regulate the water metabolism of intestinal tract. Consequently, it has a great therapeutic effect on functional constipation.

Constipation unctional/integrated Chinese traditional and western medicine therapy @Xiaofu Tongjie prescription Animal，Experiment Rats

*國家自然科學基金(81273663)；國家課題重大專項(2012ZX09103201-037)

便秘，功能性/中西醫結合療法 @硝菔通結方 動物，實驗 大鼠

R256.35

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.04.050

△通訊作者，陜西省胃腸病證方藥研究室(咸陽712046)