卷丹百合體外對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究*

艾慶燕 趙豫鳳 王愛(ài)紅 楊加周 王艷梅

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安 716000)

卷丹百合體外對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究*

艾慶燕 趙豫鳳△王愛(ài)紅 楊加周 王艷梅

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安 716000)

目的：研究百合對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549增殖作用的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞株A549，用不同濃度的百合水提物分別作用于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549細(xì)胞24、48和72 h，MTT(甲基噻唑基四唑)比色法檢測(cè)百合對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率，碘化丙啶(PI)染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變及凋亡情況。結(jié)果：MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，百合水提物在1～8mg/mL濃度范圍內(nèi)、24～72h 時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)A549的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系(P<0.05)；PI染色熒光顯微鏡觀察顯示百合作用48h后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)論：百合具有體外抑制肺腺癌細(xì)胞株A549增殖的作用，其可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制A549細(xì)胞增殖的作用。

肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]，其中75%～80%是非小細(xì)胞肺癌，其雖對(duì)放、化療敏感，但化療藥物毒副作用較大，且易產(chǎn)生耐藥和出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。從植物來(lái)源的化合物在治療癌癥中具有多方位、多靶點(diǎn)、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，符合腫瘤多因素、多環(huán)節(jié)致病的機(jī)理，對(duì)植物性藥物抗腫瘤有效部位、有效成分及作用機(jī)理的研究目前已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。百合(Lilium spp.)是多年生宿根草本植物，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)百合的化學(xué)成分提取、生物活性物質(zhì)、產(chǎn)品加工及應(yīng)用等方面進(jìn)行了大量研究。現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究證實(shí)百合具有止咳化痰、抗疲勞、耐缺氧、降血糖、抑制遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)、催眠安神、抗癌等功效[2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外培養(yǎng)的人肺癌A549細(xì)胞株，探討卷丹百合活性成分對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，為闡明百合的抗腫瘤機(jī)制及臨床應(yīng)用提供新的治療思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料 主要試劑及材料 實(shí)驗(yàn)用人肺癌細(xì)胞株A549由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心液氮保存。卷丹百合由西北農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院提供。細(xì)胞用RPMIl640培養(yǎng)基、胎牛血清( FCS)及細(xì)胞消化液胰酶(Tyrisin)均購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司；碘化丙錠( PI)、二甲基亞砜( DMSO)、MTT 等購(gòu)于美國(guó)sigma公司。熒光倒置顯微鏡采用Nikon顯微鏡，酶標(biāo)儀采用美國(guó)Bio-Rad 680 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng) 從液氮中取出凍存保種的細(xì)胞株，迅速置于37℃水浴融化，用培養(yǎng)基洗滌1次。A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37℃、飽和濕度、5%CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為RPM I-1640，含10%新生牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素) ，2～3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 卷丹百合活性成分的提取 卷丹百合球根鱗片在60 ℃下烘干，粉碎成粉末備用。稱(chēng)取5 g百合球根干粉，置于三角瓶中，加入150 mL去離子水，70℃超聲提取40min，重復(fù)1次，過(guò)濾并將濾液蒸發(fā)干，配制50mg/mL的溶液備用。

2.3 MTT 法測(cè)細(xì)胞增殖率的變化 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以1×105/mL的密度接種于96 孔板，每孔100μL，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，加入百合水提物，藥物濃度分別為1、2、4、8mg/mL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，加藥后分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加MTT溶液( 5 g /L) 20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈含MTT的培養(yǎng)液，加入二甲亞砜( DMSO) 150μL/孔，振蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物甲臜完全溶解，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)490 nm )測(cè)定每孔的光密度(OD值)，取平均值計(jì)算抑制率。以空白細(xì)胞組為對(duì)照，其細(xì)胞存活率為100%，計(jì)算處理后細(xì)胞的生存率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(% ) = (1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100 %。

2.4 PI染色法觀察肺癌細(xì)胞的形態(tài)變化 A549細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104～2×105個(gè)/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2mL，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%的融合時(shí)，加入卷丹百合水提物，濃度分別為2、4、8mg/mL作用于培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間為48h，重復(fù)三次，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變，然后以1 000 r /min 離心5 min，棄去培養(yǎng)液，2mL PBS 洗1次，加入50 mg /mL的碘化丙啶(PI)染料，避光染色30 min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變并拍照。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 百合對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用 MTT結(jié)果顯示百合在1～8mg/mL濃度范圍內(nèi)能明顯抑制體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)出時(shí)間和濃度的依賴(lài)性。隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率明顯上升(P<0.05)。相同作用時(shí)間下，隨著藥物濃度的增加，其對(duì)A549抑制作用越明顯 (P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 不同濃度百合對(duì)A549的影響(±s)

注：△與對(duì)照組比較P<0.05；▲與對(duì)照組比較P<0.01

3.2 顯微鏡下觀察百合對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的百合作用48h后A549細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變。用PI 染色后倒置熒光顯微鏡下觀察，空白組的A549細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，輪廓清晰，細(xì)胞密度大；不同濃度的百合作用48h 后的細(xì)胞與對(duì)照組相比較發(fā)生明顯的形態(tài)改變 (見(jiàn)圖1)，A549細(xì)胞皺縮、輪廓模糊，細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞間隙增大，并出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，胞核濃縮、裂解；尤其8mg/mL濃度的百合作用后細(xì)胞呈圓團(tuán)形，細(xì)胞核聚集成團(tuán)塊狀。

圖1 不同濃度百合作用48h 后A549細(xì)胞生長(zhǎng)的PI染色顯微圖(×200)

A:空白對(duì)照組； B:2mg/mL的百合作用后的細(xì)胞；C:4mg/mL的百合作用后的細(xì)胞；D:8mg/mL的百合作用后的細(xì)胞。

4 討 論 肺癌生物學(xué)特性十分復(fù)雜，惡性程度高，目前肺癌的早期診斷比較困難，約70%患者在確診時(shí)已屬Ⅲ-Ⅳ期，且發(fā)病率逐年上升，臨床多采用以化療為主的綜合治療方法，毒副作用大。尋找毒副作用小的抗腫瘤藥物是目前整個(gè)醫(yī)學(xué)界的一大課題，目前國(guó)內(nèi)外抗腫瘤藥物研究的一個(gè)重要方向是從天然產(chǎn)物(植物或中草藥)提取具有毒副作用小的治療惡性腫瘤的成分[3,4]。我國(guó)是應(yīng)用和栽培百合最早的國(guó)家，中藥百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，百合肉質(zhì)鱗莖的鱗片，性味甘寒，有養(yǎng)陰清肺、清心安神之功，具有較好的藥用價(jià)值和保健功能。近年來(lái)對(duì)百合的化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用方面已做了大量研究，發(fā)現(xiàn)百合球莖中含有多種生物活性成分，如多糖、甾體皂甙及類(lèi)黃酮、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、維生素、生物堿、磷脂、無(wú)機(jī)元素、膳食纖維等物質(zhì)。

本研究MTT結(jié)果表明，百合在體外對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)性，尤其8 mg/mL的百合作用72 h 后，對(duì)肺癌細(xì)胞抑制率可高達(dá)54.56%，由于本研究采用的是百合的粗提取物，說(shuō)明百合的多種生物活性成分具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用。百合中的甙類(lèi)為甾體皂苷，根據(jù)甙元結(jié)構(gòu)的不同，可將其歸納為螺甾皂苷、異螺甾皂苷、呋甾皂苷、變形螺甾烷皂苷四大類(lèi)，從百合中分離得到的甾體類(lèi)化合物共有47個(gè)[5]，百合皂苷及其衍生物能抑制TPA 刺激的宮頸癌細(xì)胞，并抑制各種人類(lèi)惡性腫瘤細(xì)胞，如胰腺癌、骨肉瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤等[6]。有研究表明白首烏甾體皂苷類(lèi)成分K1N可通過(guò)阻滯A549肺癌細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，C1N、C2N將肺癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，阻止受損細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成而抑制肺癌細(xì)胞的過(guò)度增殖[7]。所以筆者推測(cè)百合皂苷具有抗腫瘤、抗癌活性，并且其可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)。百合含秋水仙堿能抑制癌細(xì)胞的增殖，作用機(jī)理是抑制腫瘤細(xì)胞的紡錘體，使其停留在分裂中期，不能進(jìn)行有效的有絲分裂。多糖成分抗腫瘤活性的作用表現(xiàn)為提高宿主免疫功能，也有對(duì)腫瘤細(xì)胞直接殺傷和抑制的作用。純化百合多糖能抑制H22小鼠肝癌生長(zhǎng)，同時(shí)能增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能[8]。LBPS-I多糖對(duì)移植性黑色素B16和Lewis肺癌有較強(qiáng)的抑制作用。百合中的多種活性成分可能作用于癌細(xì)胞的不同階段，使細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成受到嚴(yán)重阻礙，或破壞癌細(xì)胞膜，引起肺癌細(xì)胞死亡。

凋亡是受基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，腫瘤細(xì)胞的凋亡受到許多凋亡調(diào)控基因及酶的影響，細(xì)胞增殖過(guò)度，凋亡受阻是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征之一。黃酮類(lèi)化合物抗腫瘤通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，干擾腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和控制基因表達(dá)以及抑制血管生成等體現(xiàn)[9]。黃酮類(lèi)化合物可以激活乳腺癌細(xì)胞中的DCL腫瘤抑制基因，抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期停滯在G2-M，進(jìn)而誘導(dǎo)p21Waf1基因表達(dá)，引起腫瘤凋亡，還能通過(guò)抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性，作用于腫瘤細(xì)胞[9]。本實(shí)驗(yàn)中百合作用48h后的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)PI染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生了明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞形狀模糊，細(xì)胞間隙增大，出現(xiàn)了凋亡細(xì)胞形態(tài)的改變。說(shuō)明百合可以誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，這可能是百合抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的另一機(jī)制。

百合是衛(wèi)生部審批通過(guò)的首批藥食兩用品之一，是一療效確切安全可靠的防病治病之品，其特點(diǎn)是來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、不良反應(yīng)輕。百合抗瘤機(jī)制與傳統(tǒng)化療藥有著完全不同的特點(diǎn)，并可與其他抗癌藥協(xié)同增效，因此在確定其抗癌活性的基礎(chǔ)上，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)百合成分的深入研究，有望獲得低毒并具有明確抗腫瘤作用和機(jī)制的抗癌藥物，將具有良好的發(fā)展前景。

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(收稿2014-11-15；修回2014-12-11)

Depressant effects of Lilium lancifolium on human pulmonary adenocarcinoma cell line A549in vitro

Medical College of Yan’an University(Yan’an 716000)

Ai Qingyan Zhao Yufeng Wang Aihong et al

Objective：Investigate the effects of Lilium lancifoliumon inhibition of pulmonary adenocarcinoma cell line A549in vitro and explore its mechanism．Methods：The A549cells in vitro were treated with Lilium lancifolium at different concentrations to 24h,48h and 72h respectively. MTT assay was used to examine the proliferation．PI staining were used to observe the morphological changes of cancer cells．Results：The depressant effects of Lilium lancifolium on human A549were determined by MTT assay after at 24h, 48h and 72h.The concentration of Lilium lancif olium was 1～8mg/mL. Lilium lancifolium could obviously inhibit proliferation of A549cells, the effect was a time-dose-dependen tmanner(P<0.05). Pl Fluorescence microscope indicated that apoptotic change was observed in A549cells after treatment with Lilium lancifolium for 48h. Conclusion：Lilium lancifolium can inhibit the growth of A549cells remarkably by inducing apoptosis and blocking cell cycle．

Lung Neoplasms/experiment research Apoptosis @Lilium

*延安市科技項(xiàng)目 (2013-kw03 )

肺腺癌/實(shí)驗(yàn)研究 細(xì)胞凋亡 @百合

R730.5

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.04.051

△通訊作者