歸腎育宮湯對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas/FasL蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究*

符小航 符海鴿 賀豐杰 車虹彩 楊鑒冰 崔曉萍

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽(yáng) 712046)

歸腎育宮湯對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas/FasL蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究*

符小航 符海鴿△賀豐杰▲車虹彩 楊鑒冰▲崔曉萍▲

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽(yáng) 712046)

目的：觀察歸腎育宮湯對(duì)卵巢早衰小鼠卵泡細(xì)胞Fas/FasL蛋白表達(dá)的影響，揭示該方治療卵巢早衰的作用機(jī)制。方法：60只雌性昆明小鼠，隨機(jī)分成正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、歸腎育宮湯大、中、小劑量組，每組10只；采用免疫法復(fù)制小鼠卵巢早衰模型，給藥4周后，HE染色觀察病理組織學(xué)變化，免疫組化法檢測(cè)卵泡顆粒細(xì)胞Fas/FasL蛋白表達(dá)。結(jié)果：各組大鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas/FasL的表達(dá)比較，歸腎育宮湯大、中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型組有顯著性差異(P<0.01)；組間比較，歸腎育宮湯大、中劑量組優(yōu)于雌激素組(P<0.01)。結(jié)論：歸腎育宮湯能有效抑制卵泡顆粒細(xì)胞Fas/FasL蛋白的表達(dá)，對(duì)卵巢早衰小鼠的卵巢顆粒細(xì)胞過(guò)度凋亡有抑制作用。

卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)是指40歲之前婦女出現(xiàn)持續(xù)性閉經(jīng)，并伴有促卵泡生成素和促黃體生成素升高、雌激素降低的綜合征[1]。因其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制不明，治療難度大，是目前婦科中的難治疾病之一。陜西省名中醫(yī)楊鑒冰教授根據(jù)“腎主生殖”理論，結(jié)合多年臨床實(shí)踐創(chuàng)立了以“補(bǔ)腎”為主要治法的歸腎育宮湯，該方由熟地、枸杞子、山萸肉、菟絲子、山藥、茯苓、紫河車、鹿角霜、杜仲、川斷、制首烏、雞血藤、焦山楂、炙甘草組成，大隊(duì)補(bǔ)陰藥中配伍少量補(bǔ)陽(yáng)藥以陽(yáng)中求陰，具有滋補(bǔ)腎精、充養(yǎng)胞宮的功效，經(jīng)多年臨床驗(yàn)證療效確切。現(xiàn)代研究表明，卵巢顆粒細(xì)胞過(guò)度凋亡是導(dǎo)致卵巢早衰的主要原因之一，卵巢顆粒細(xì)胞既能分泌雌激素和孕激素，又在卵泡的發(fā)育和成熟中發(fā)揮著重要作用，因此，調(diào)節(jié)卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡可能為治療卵巢早衰提供新的靶點(diǎn)。故本實(shí)驗(yàn)采用透明帶多肽多點(diǎn)注射免疫法復(fù)制卵巢早衰小鼠模型，通過(guò)觀察歸腎育宮湯對(duì)模型小鼠卵巢顆粒細(xì)胞調(diào)控蛋白Fas/FasL的影響，探討該方的作用機(jī)理，為中醫(yī)藥治療POF提供依據(jù),現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯報(bào)如下：

1 材 料

1.1 動(dòng)物 雌性昆明小鼠60只，體重(20±5)g，合格證號(hào)：SCX(陜)2007-001，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物及試劑 歸腎育宮湯組方：枸杞子、川斷各12g，菟絲子20g，熟地、山萸肉、杜仲、紫河車、鹿角霜各10g，茯苓、山藥、制首烏、雞血藤、焦山楂各15g，炙甘草6g，所有中藥材購(gòu)于百姓樂(lè)大藥房，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定為合格藥品，常規(guī)煎煮濃縮后備用；結(jié)合雌激素片：新疆新姿源生物制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20130402。

1.3 透明帶多肽3(ZP3) 美國(guó)GenScript公司，純度98.1%，批號(hào)：5004321_1；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑: 美國(guó)Sigma 公司；Fas、FasL一抗：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器與設(shè)備 圖像采集系統(tǒng) NIKON.ACT-1 DXM1200 日本尼康公司；光學(xué)顯微鏡：蔡司光學(xué)儀器(上海)國(guó)際貿(mào)易公司。

2 方 法

2.1 POF模型制備 ①取ZP3粉末1.4445mg溶入1mL三蒸水中配置成ZP3溶液；②ZP3溶液分別和和弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑按1∶1配制成免疫試劑和免疫強(qiáng)化試劑；③分別于第1天和第14天取0.1mL免疫試劑和免疫強(qiáng)化試劑注射于小鼠雙后腳掌及腹腔皮下。

2.2 分組及給藥 60只雌性昆明小鼠稱重后，根據(jù)體重分層，采用隨機(jī)法分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、歸腎育宮湯大、中、小劑量組，每組10只。陽(yáng)性對(duì)照組用結(jié)合雌激素片0.125mg/kg·d，各治療組按歸腎育宮湯大劑量組70g/kg·d、中劑量組35g/kg·d、小劑量組17.5g/kg·d灌胃，正常組、模型組灌胃相同量生理鹽水，連續(xù)灌胃4周。

2.3 卵泡顆粒細(xì)胞 Fas、FasL蛋白表達(dá)的測(cè)定：取小鼠卵巢，制成厚度3μm，脫蠟脫水，3%雙氧水室溫孵育10min，蒸餾水沖洗、PBS浸泡5 min，2次，10%山羊血清封閉，室溫孵育10min，分別滴加Fas、FasL一抗4℃過(guò)夜，二抗37℃孵20min，滴加適量辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20min，顯色劑顯色3～15min，沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。采用Zeiss ImergerAl顯微鏡觀察到陽(yáng)性細(xì)胞后，用DXM1200FCCD圖像采集系統(tǒng)采集圖片，對(duì)采集到的圖像應(yīng)用Image-Pro Plus5.1分析系統(tǒng)測(cè)定其積分光密度。

3 結(jié) 果 歸腎育宮湯對(duì)卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)的影響 正常組小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas蛋白很少表達(dá)，F(xiàn)asL蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá)；與空白組比較，模型組小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，歸腎育宮湯大、中、小劑量組小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.01)，表明雌激素、歸腎育宮湯均可通過(guò)降低小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas、FasL蛋白的表達(dá)抑制卵泡顆粒細(xì)胞的過(guò)度凋亡；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，歸腎育宮湯大、中劑量組小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)減弱(P<0.01)，小劑量無(wú)差異(P>0.05)；歸腎育宮湯各治療組間比較，各組間小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)均有差異(P<0.01)，表明歸腎育宮湯對(duì)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)的影響與劑量成正比關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasL蛋白積分光密度(IOD)的比較

注：與正常組比較，▲P<0.01；與模型組比較，◆P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，●P<0.01；與大劑量組比較，△P<0.01

4 討 論 目前卵巢早衰的發(fā)病率逐年上升，多位學(xué)者從不同角度對(duì)卵巢早衰的病因進(jìn)行了研究，分子、基因、蛋白等多個(gè)層次的研究結(jié)果均表明在卵泡顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵巢早衰的重要原因[2-3]。Fas及其配體FasL是一對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白因子，F(xiàn)asL蛋白能與Fas特異性親和，激活Fas蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路[4]。因此調(diào)節(jié)Fas及其配體FasL的表達(dá)，能有效抑制卵泡顆粒細(xì)胞的過(guò)度凋亡對(duì)卵巢早衰起到治療作用。朱萱萱[5]等研究表明，卵巢早衰大鼠存在卵泡顆粒細(xì)胞的過(guò)度凋亡以及Fas/FasL蛋白表達(dá)的失衡。本此實(shí)驗(yàn)根據(jù)自身免疫異常的機(jī)制采用透明帶多肽成功復(fù)制了POF小鼠動(dòng)物模型，模型成功后可見(jiàn)Fas、FasL蛋白表達(dá)的顯著升高，經(jīng)歸腎育宮湯給藥治療后，可見(jiàn)陽(yáng)性對(duì)照組、大、中、小劑量組小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)，組間比較發(fā)現(xiàn)歸腎育宮湯大、中劑量組藥物療效優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥，表明歸腎育宮湯能通過(guò)調(diào)節(jié)Fas/FasL蛋白表達(dá)間的平衡抑制卵泡顆粒細(xì)胞過(guò)度凋亡對(duì)卵巢早衰起到治療作用。

[1] 曹澤毅.中華婦產(chǎn)科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1999：138

[2] 劉慧萍,尤昭玲,雷 磊,等.補(bǔ)腎活血方對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠卵泡凋亡調(diào)控基因( Bcl-2 /Bax) 蛋白的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010,28(5):1036-1038．

[3] Massin N，Meduri G，Bachelot A，et al． Evaluation of different markers of the ovarian reserve in patients presenting with premature ovarian failure[J].Mol Cell Endocrinol，2008，282( 1-2) : 95-100．

[4] Coffey JC,Bennett MW,Wang JH,et al.Up regulation of Fas-FasL(CD95/CD95L)-mediated epithelial apoptosis[J].A putative role in pouchitis? J Surg Res,2001，98(1):27-32.

[5] 朱萱萱,王海丹,王 進(jìn),等.烏鱉顆粒對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠 CD4+/CD8+及 Fas,FasL 蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,29(12): 2605-2607.

(收稿2015-06-17；修回2015-07-10)

*陜西省教育廳項(xiàng)目(11JK0693)

△興平海派醫(yī)院(興平713100)

▲陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng)712046)

卵巢早衰/中醫(yī)藥療法 @歸腎育宮湯 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 小鼠

R711.75

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.10.089

陜西省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(13-JC003)

陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院院內(nèi)項(xiàng)目(201201)