抗癌方有效部位群對荷瘤小鼠的抑瘤作用*

李 雅 范引科 姜姍姍 楊 潔 趙 崗 謝人明

陜西省腫瘤醫院 (西安 710061)

抗癌方有效部位群對荷瘤小鼠的抑瘤作用*

李 雅 范引科△姜姍姍△楊 潔△趙 崗△謝人明△

陜西省腫瘤醫院 (西安 710061)

目的：觀察抗癌方有效部位群對小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌瘤體的抑制作用及腫瘤壞死因子(TNF)活性的影響。方法：通過小鼠移植性S180肉瘤生長試驗、小鼠移植性H22肝癌瘤株生長試驗及采用MTT法測定腫瘤壞死因子(TNF)活性試驗，觀察抗癌方對S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠的瘤體重量、抑瘤率及腫瘤壞死因子(TNF)活性的影響。結果：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)能夠明顯抑制小鼠移植性S180、H22荷瘤小鼠瘤體的生長，減少瘤體重量、增強抑瘤率(P<0.01，P<0.05)；抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg) 明顯升高TNF活性(P<0.05或0.01)。結論：抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌具有顯著的抑瘤作用，增強腫瘤壞死因子(TNF)活性是其可能作用機制之一。

惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的疾病之一，我國已進入老齡化社會，腫瘤發病率及死亡率呈高發趨勢，從天然植物中尋找低毒、高效的抗癌活性成分藥物仍是近年來國內外學者熱衷的研究課題。

抗癌方有效部位群(簡稱抗癌方)出自我院名老中醫驗方，由蟾皮、莪術、延胡索等諸藥配伍組合而成，具有解毒散結，活血祛瘀，行氣止痛之功效。臨床觀察證實用于肝癌、胃癌等多種腫瘤及癌痛的治療具有較好效果。我們通過抑瘤實驗等系列全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機理，為闡明其科學內涵，進一步臨床應用提供充分的科學依據。

1 實驗材料 1.1 受試藥物 抗癌方，由蟾皮、莪術、延胡索等諸藥經提取得到有效部位配伍組合而成,含蟾毒配基類化合物，莪術揮發油類，異喹啉類生物堿等多種成分，具有解毒散結，活血祛瘀，行氣止痛之功效。1g藥粉相當3.02 g原生藥。

1.2 陽性藥物 注射用環磷酰胺，批準文號(國藥準字號H14023686)，山西普德藥業股份有限公司生產，規格：0.2g。

1.3 瘤 株 小鼠S180肉瘤細胞株，肝癌H22細胞株，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1.4 實驗動物 KM小鼠，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，體重18～22g，許可證號：SCXK(陜)2010-001。

1.5 試劑及儀器 氯化鈉注射液:西安京西雙鶴藥業有限公司生產；標準胎牛血清： TBD31HB， 100mL，Gibco公司；胰蛋白酶消化液：西安舟鼎國公司；二甲基亞砜(DMSO)：美國Solarbio公司；刀豆蛋白A(ConA)：西安舟鼎國公司；RPMI-1640 ：Gbico公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)：西安舟鼎國公司； 96孔培養板:美國Corning公司；電子天平：型號：BS210S 北京賽多利斯天平廠；普通光學顯微鏡：olympus 生產；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺，型號：NO.0904192，蘇州凈化設備有限公司生產；恒溫培養箱：Heraeus ；酶標儀：BIO-RAD Model 680 serial NO.13628 Made in Japan。

2 實驗方法 2.1抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤生長的影響 按文獻方法[1-2]，取KM小鼠50只，體重18～22g，每次試驗均采用單一性別，在潔凈工作臺內制備瘤細胞懸液(1×107個/mL)，每只小鼠無菌條件下腋下接種瘤細胞懸液0.2mL，計瘤細胞數約為2×106個。24h后按體重隨機分為5組，分別為荷瘤對照組(常水,10mL/kg)、陽性對照組(環磷酰胺,20mg/kg)和抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)。各組灌胃體積均為10mL/kg，1d1次，連續給藥10d。末次給藥后次日，稱體重后處死小鼠，剖取瘤塊，計算體重和抑瘤率,試驗重復2次, 統計學處理t檢驗。

2.2 抗癌方對小鼠H22肝癌瘤株生長及腫瘤壞死因子(TNF)活性的影響 2.2.1 按文獻方法[1-2]，KM小鼠50只，雄性，體重 18～22g。在潔凈工作臺內無菌操作制備小鼠肝癌瘤細胞懸液(1×107個/mL)，每只小鼠無菌條件下右前肢腋部皮下接種肝癌細胞懸液0.2mL，計瘤細胞數約為2×106個。24h后按體重隨機分為五組: 荷瘤對照組(常水,10mL/kg)、陽性對照組(環磷酰胺,20mg/kg)和抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)。各組灌胃體積均為10mL/kg，1d1次，連續給藥10d。 末次給藥后1.5h,稱小鼠體重后處死，無菌制備脾細胞懸液[3]；解剖取瘤稱重，按公式計算腫瘤抑瘤率，統計學處理t檢驗。

2.2.2 TNF的誘生活性測定[3]:將制備的小鼠脾細胞懸液用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液調整細胞濃度為1×106/mL，接種于24孔培養板，每孔500μL，每孔再加終濃度為5μg/mL的ConA，500μL/孔，37 ℃ 5%CO2培養箱內培養48 h后，取上清液備用。

采用MTT法測定TNF的活性[3]將生長良好的L929細胞消化液消化配制成4×105/mL，接種于96孔培養板100μL/孔，將待測樣品也加入培養板100μL/孔，每只待測樣品均設5孔，同時設靶細胞對照，加入靶細胞和RPMI-1640各100μL。37℃ 5%CO2培養箱內培養48 h后，輕輕吸去上清液100μL，加入MTT(1mg/mL)試液100μL，37℃ 5%CO2培養箱內培養2 h后，吸棄上清液，每孔加DMSO100μL，作用30min，用酶標測定儀測570nm處的吸收度,統計學處理采用t檢驗。

3 實驗結果 3.1 抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤生長的影響 由表1、表2結果可見：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)、 陽性對照組(環磷酰胺,20mg/kg)能明顯抑制小鼠移植性S180瘤體的生長(P<0.01,P<0.05)，且呈一定劑量關系。

表1 抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤生長的影響(♂)

注：與荷瘤對照組相比,△P<0.05；▲P<0.01

表2 抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤生長的影響(♀)

注：與荷瘤對照組比較,△P<0.05；▲P<0.01

3.2抗癌方對小鼠H22肝癌瘤體生長的影響 由表3結果可見：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)、 陽性對照組(環磷酰胺,20mg/kg)明顯抑制小鼠移植性H22肝癌瘤體的生長(P<0.01)，抑瘤率分別達到57.20%、46.51%、36.74%、78.60%，試驗呈現出良好的量效關系。

表3 抗癌方對小鼠移植性肝癌生長的影響

注：與荷瘤對照組相比: △P<0.05；▲P<0.01

3.3 抗癌方對小鼠H22肝癌瘤株TNF(腫瘤壞死因子)活性測定 由表4結果可見：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)與荷瘤對照組比較TNF活性明顯升高 (P<0.05或0.01)，環磷酰胺組與荷瘤對照組比較，具有降低TNF活性的作用(P<0.01)。

表4 抗癌方對小鼠H22肝癌瘤株

注：與荷瘤對照組相比: △P<0.05 ；▲P<0.01

4 討 論 惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的疾病之一，腫瘤發病率及死亡率呈高發趨勢。2l世紀初，我國每年死于癌癥的人數已高達150萬[4]。

近年來的研究表明，蟾皮抗腫瘤作用主要是蟾毒配基類，對白血病細胞、實體瘤細胞都有生長抑制和誘導分化作用，證實它可以誘導腫瘤細胞的分化和凋亡還能抑制腫瘤血管和血管內皮增生[5]。國內學者已從不同角度和層次證明了莪術及其抗腫瘤成分莪術醇、欖香烯、莪術酮等的抗腫瘤作用[6]；延胡索的主要成分中延胡索乙素鎮痛作用最強,科學實驗表明延胡索具有很好的鎮痛、鎮靜和催眠的藥理作用[7]。TNF是迄今發現的直接殺傷腫瘤作用最強的生物學活性因子之一，能選擇性殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞增殖，而不影響正常細胞的生長、分化和代謝功能，且能協同其它生物學因子功能，擴大抗腫瘤譜[3]。

本研究結果表明抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌具有顯著的抑瘤作用，能夠增強腫瘤壞死因子(TNF)活性。實驗結果提示抗癌方既具有抑制腫瘤生長的作用，又具有調節抗腫瘤細胞活性因子TNF增強對腫瘤細胞的殺傷作用。說明抗癌方可誘導機體產生TNF,通過TNF直接殺傷腫瘤細胞是其抗腫瘤作用機制之一。

抗癌方中多種中藥來源的化學成分不僅對腫瘤細胞具有直接的細胞毒殺傷作用,而且能夠從不同途徑提高腫瘤患者的免疫功能,這將為我們找到療效確切、毒副作用小的抗腫瘤藥物而奠定基礎[8]。我們將繼續通過抗腫瘤免疫實驗等進一步全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機理，為臨床應用提供充分的科學依據。

[1] 魏 偉.藥理實驗方法學[M].第四版.北京：人民衛生出版社，2010： 1072-1074.

[2] 陳 奇.中藥藥理研究方法學[M].第三版.北京：人民衛生出版社，2011: 706-712.

[3] (美)拉波薩塔(Laposata；M.)原著.高德祿,張世俊,主譯.臨床免疫學方法[M]. 北京：人民軍醫出版社,2012:512-515,638-651.

[4] 吳 菲,林國楨,張晉昕.我國惡性腫瘤發病現狀及趨勢[J].中國腫瘤,2012,21(2):81-83.

[5] 王曉東,嚴子平,張 莉,等.蟾皮提取分離方法及有效成分的研究進展[J]. 武警醫學院學報,2011,24(12):1757-1767.

[6] 徐燕萍,胡小慶,湛學軍.莪術對免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].山東醫藥,2012,52(4):51-53.

[7] 呂子明,孫武興,段緒紅,等. 延胡索化學成分研究 [J].中國中藥雜志,2012,32(2):1757-1767.

[8] 白 云,劉 萍,賈博宇.中藥抗腫瘤作用的研究進展[J].中國藥師,2014,17(8):1406-1409.

(收稿2015-06-05；修回2015-07-19)

*陜西省中醫藥管理局課題(2012-JC18)

@抗癌方 腫瘤壞死因子 動物實驗 小鼠

R73-3

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.047

△陜西省中醫藥研究院(西安 710003)