康婦炎膠囊對兔盆腔炎性疾病后遺癥模型粘連相關(guān)指標影響的實驗研究*

蔡 競 賀豐杰 朱虹麗 孫 康 劉 霞

陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院婦科(咸陽712000)

康婦炎膠囊對兔盆腔炎性疾病后遺癥模型粘連相關(guān)指標影響的實驗研究*

蔡 競 賀豐杰 朱虹麗 孫 康 劉 霞

陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院婦科(咸陽712000)

目的： 通過觀察康婦炎膠囊對盆腔炎性疾病(PID)后遺癥模型兔子宮、輸卵管組織粘連相關(guān)指標細胞間粘附分子-1(ICAM-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-a)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響，從抗粘連方面探討康婦炎膠囊治療盆腔炎性疾病后遺癥的機制。方法： 將5～6個月齡新西蘭雌兔分為：正常組、模型組、桂枝茯苓組、康婦炎組，除正常組外，其余3組均通過逆行宮腔插管灌注細菌法建立盆腔炎模型，造模成功后，模型組、桂枝茯苓組、康婦炎組分別灌服蒸餾水、桂枝茯苓膠囊、康婦炎膠囊3周，正常組灌服蒸餾水。肉眼觀察各組兔子宮及輸卵管情況；HE染色觀察各組兔子宮、輸卵管組織學變化；免疫組化及免疫印跡法檢測各組兔子宮、輸卵管組織ICAM-1、 TNF-a、VEGF表達的變化。結(jié)果：肉眼觀察模型組兔腹膜明顯增厚，盆腔積液，子宮充血，質(zhì)脆，彈性差，輸卵管管壁粗糙、增厚，與周圍組織粘連，或外觀略呈串珠樣；康婦炎組兔腹膜增厚不明顯，無盆腔積液，子宮無明顯充血，輸卵管與周圍組織無明顯粘連；康婦炎組兔子宮、輸卵管組織ICAM-1、 TNF-a、VEGF表達較模型組明顯降低(P<0.05 或P<0.01)。結(jié)論：康婦炎膠囊治療PID后遺癥可能與其降調(diào)子宮、輸卵管組織粘連相關(guān)指標ICAM-1、TNF-α、VEGF的表達有關(guān)。

盆腔炎性疾病 (Pelvic inflammatory disease,PID) 后遺癥是因盆腔炎性疾病未及時治療或治療不當,病程遷延而致。其病理表現(xiàn)以組織破壞、粘連、增生、瘢痕形成為主,患者臨床癥狀主要表現(xiàn)為反復下腹疼痛或下腹墜脹感、腰骶酸痛、白帶異常等,遠期可出現(xiàn)不孕、異位任娠及慢性盆腔痛、盆腔炎性疾病反復發(fā)作等，嚴重降低了婦女的生活質(zhì)量。本研究復制前期實驗建立的PID后遺癥兔模型[1]，通過觀察康婦炎膠囊對模型兔盆腔組織ICAM-1、TNF-α、VEGF粘連相關(guān)指標的影響，從抗粘連方面探討康婦炎膠囊對PID后遺癥治療作用的機制，為其臨床治療本病提供可靠的實驗室依據(jù)。

1 實驗動物 5～6 個月齡健康新西蘭雌兔36只，性成熟，未交配。購自西安交通大學實驗動物中心，合格證號：醫(yī)動字第08-018。飼養(yǎng)環(huán)境：陜西中醫(yī)學院中藥藥理實驗室，動物分籠飼養(yǎng)，保持12h晝夜節(jié)律，室溫(22±1)℃，自由飲水攝食。

2 藥品及試劑 康婦炎膠囊(山東步長神州制藥有限公司，批號131118。成分為蒲公英、敗醬草、薏苡仁、赤芍、蒼術(shù)、當歸、川芎、香附、延胡索(制)、澤瀉、白花蛇舌草，0.4g/粒，48粒/盒)、桂枝茯苓膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號130907，成分桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍，0.31g/粒，10粒/盒)、細胞粘附分子(ICAM - 1)抗體(批號：bs-4615R)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TNF-α)抗體(批號：bs-2081R)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體(批號：bs-1665R)，均購自博奧森公司。

3 實驗方法 3.1 菌液制備 于實驗前1 h，將大腸埃希菌標準株加金黃色葡萄球菌標準菌株的肉湯增菌液稀釋為 1×107/L 濃度菌液[2]。

3.2 造模方法 實驗前 6 h，每只兔肌內(nèi)注射孕馬血清50 IU。宮腔插管灌注細菌：兔固定暴露外陰后，將長約 12 cm、直徑約1mm 的一次性無菌橡膠管插入兔陰道內(nèi)約 7～8 cm；回抽順利無液體，證明插管順利進入宮腔。經(jīng)插管注入混合菌液(1 mL/kg)，觀察 30 s，無液體外溢，將兔倒置 3 min 后放回飼養(yǎng)籠[2]，第49天靜脈麻醉后行剖腹探查術(shù) 1 次，觀察盆腔臟器外觀變化，當觀察到所有動物子宮充血、質(zhì)脆，輸卵管管壁粗糙、增厚，與周圍組織粘連，或外觀略呈串珠樣改變時確定造模成功，常規(guī)關(guān)腹。

3.3 分 組 實驗兔按體質(zhì)量用SPSS13.0統(tǒng)計軟件完全隨機法隨機分為正常組、模型組、桂枝茯苓組、康婦炎組，每組9只。除正常組外其余3組均造模，造模成功后模型組、桂枝茯苓組、康婦炎組分別灌服蒸餾水、桂枝茯苓膠囊、康婦炎膠囊3周，正常組灌服蒸餾水。各組用藥劑量根據(jù)臨床人用劑量換算家兔給藥量，具體如下：正常組和模型組予蒸餾水5mL/只灌胃，1d1次；桂枝茯苓組：桂枝茯苓膠囊溶于溫開水中，以0.12g/kg灌胃，1d1次；康婦炎組：康婦炎膠囊溶于溫開水中，以0.154g/kg灌胃，1d1次；以上各組均于造模成功后給藥，連續(xù)給藥3周。

3.4 觀察盆腔臟器變化及標本采集 給藥3周后，次日清晨戊巴比妥鈉耳靜脈麻醉，剖腹探查觀察盆腔臟器變化，處死，摘取子宮及雙側(cè)輸卵管，精密稱量，

將子宮從正中間切開，一半放入10%中性甲醛溶液中固定備HE染色及免疫組化(S-P)法檢測用；另一半置入液氮罐中保存?zhèn)涿庖哂≯E法檢測用。

3.5 HE染色觀察各組兔子宮及輸卵管組織形態(tài)學變化 組織經(jīng)10%中性甲醛溶液浸泡，石蠟包埋，切片，常規(guī)二甲苯透明，酒精梯度脫水，蘇木精-伊紅染色法(HE)常規(guī)染色，顯微鏡下觀察。

3.6 免疫組化S-P法檢測各組兔子宮、輸卵管組織中ICAM-1、 TNF-α、VEGF的表達 組織經(jīng)10% 中性甲醛溶液48h充分固定后，石蠟包埋，切片，二甲苯透明，梯度酒精脫水，進行ICAM-1、 TNF-a、VEGF免疫組織化學染色。每組每張切片在200倍的光學顯微鏡下，選取每只大鼠免疫組化染色切片面積大致相同的 5 個視野，BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析各張切片的灰度值，取5個視野平均值作為該切片最后結(jié)果。

3.7 免疫印跡法檢測各組兔子宮、輸卵管組織中ICAM、TNF-α、VEGF的表達 將組織標本剪碎，提蛋白并測定蛋白濃度， SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，膜封閉，一抗、二抗孵育，顯色，曝光于X膠片上，常規(guī)顯影、定影。內(nèi)參照為鼠抗人GAPDH單抗(1：5000)。結(jié)果經(jīng)圖像分析軟件處理，得出相對灰度值。

4 結(jié) 果 4.1 各組兔子宮及輸卵管組織形態(tài)學變化

4.1.1 肉眼觀察兔盆腔：正常組腹膜正常，子宮、輸卵管形態(tài)、色澤正常，組織堅韌，與周圍組織無粘連；模型組腹膜增厚，盆腔有積液，子宮充血，質(zhì)脆，彈性差；輸卵管管壁粗糙、增厚，與周圍組織粘連，或外觀略呈串珠樣。桂枝茯苓組腹膜輕度增厚，無盆腔積液，子宮輕度充血，彈性差；輸卵管管壁粗糙，輕度增厚，部分與周圍組織粘連。康婦炎組腹膜增厚不明顯，無盆腔積液，子宮充血不明顯，彈性可；輸卵管管壁光滑，無增厚，與周圍組織無粘連。

4.1.2 鏡下情況：正常組子宮壁結(jié)構(gòu)整齊，腺體結(jié)構(gòu)清晰；輸卵管血管無擴張，無淋巴細胞聚集。模型組子宮壁組織結(jié)構(gòu)紊亂，腺體明顯減少，灶狀淋巴細胞聚集，多量漿細胞；輸卵管血管擴張明顯，散在淋巴細胞浸潤。桂枝茯苓組輸卵管間質(zhì)內(nèi)灶狀淋巴細胞。康婦炎組子宮壁結(jié)構(gòu)基本接近正常，腺體增多，少量漿細胞；輸卵管擴張不明顯，少量淋巴細胞，炎癥不明顯。見圖1。

4.2 各組兔子宮、輸卵管組織中ICAM-1、 TNF-α、VEGF表達比較 4.2.1 各組兔子宮、輸卵管組織中ICAM-1表達比較:兩種檢測方法顯示：與正常組比較，模型組兔子宮、輸卵管組織ICAM-1表達均增多(P<0.01)；與模型組比較， 康婦炎組組兔子宮、輸卵管組織 ICAM-1表達均降低(P<0.01)，桂枝茯苓組略有降低，但無統(tǒng)計學意義；與桂枝茯苓組比較，康婦炎組兔子宮、輸卵管組織 ICAM-1均降低(P<0.01)。說明康婦炎膠囊降調(diào)ICAM-1的效果優(yōu)于桂枝茯苓膠囊。結(jié)果見表1。

表1 各組兔子宮、輸卵管組織ICAM-1表達比較

注：與正常組比較 △P<0.05， ▲P<0.01；與模型組比較 ◇P<0.05， ◆P<0.01 ；與桂枝茯苓組比較□P<0.05,■P<0.01

4.2.2 各組兔子宮、輸卵管組織中TNF-α表達比較：兩種檢測方法顯示：與正常組比較，模型組兔子宮、輸卵管組織TNF-α表達均增多(P<0.01)；與模型組比較， 康婦炎組兔子宮、輸卵管組織TNF-α表達均降低(P<0.01)，桂枝茯苓組免疫印跡法降低(P<0.01)；與桂枝茯苓組比較，康婦炎組兔子宮、輸卵管組織TNF-α均降低(P<0.05)。說明康婦炎膠囊降調(diào)TNF-α的效果優(yōu)于桂枝茯苓膠囊。結(jié)果見表2。

表2 各組兔子宮、輸卵管組織TNF-α表達比較

注：與正常組比較 △P<0.05， ▲P<0.01；與模型組比較 ◇P<0.05， ◆P<0.01 ；與桂枝茯苓組比較□P<0.05,■P<0.01

4.2.3 各組兔子宮、輸卵管組織中VEGF表達比較:兩種檢測方法顯示：與正常組比較，模型組兔子宮、輸卵管組織VEGF表達均增多(P<0.01)；與模型組比較， 康婦炎組、桂枝茯苓組兔子宮、輸卵管組織VEGF表達均降低(P<0.01)；與桂枝茯苓組比較，康婦炎組兔子宮、輸卵管組織VEGF均降低(P<0.05或P<0.01)。說明康婦炎膠囊降調(diào)VEGF的效果優(yōu)于桂枝茯苓膠囊。結(jié)果見表3。

表3 組兔子宮、輸卵管組織VEGF表達比較

注：與正常組比較 △P<0.05， ▲P<0.01；與模型組比較 ◇P<0.05， ◆P<0.01 ；與桂枝茯苓組比較□P<0.05,■P<0.01

5 討 論 盆腔炎性疾病后遺癥是盆腔感染后期持續(xù)存在的慢性炎癥狀態(tài)，以局部廣泛纖維化為特征。細胞間粘附分子-1(ICAM-l) 在慢性炎癥中,誘導了組織損傷及局部組織慢性纖維化過程，如果 ICAM-1 的表達被下調(diào)、被抑制，則炎癥反應將減輕，故減輕組織中ICAM-1的表達在阻斷、減輕炎癥及瘢痕形成中起重要作用[2]。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α))是一種具有細胞毒性作用及誘導炎性細胞釋放毒性物質(zhì)的作用細胞毒細胞因子,可刺激成纖維細胞增生、促進膠原酶釋放等作用參與組織損傷過程[3]，盆腔炎性疾病患者腹腔液及血清TNF-α與盆腔粘連呈顯著性相關(guān)，局部TNF-α越高，盆腔局部粘連越重[4]。因此，TNF-α也被稱為腹腔內(nèi)粘連形成標志物。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)又名血管通透因子(Vascular permeability factor，VPF)，不同程度的表達于人體的多個組織中，炎性細胞能促進 VEGF 的形成，而 VEGF 的高表達，促使粘連組織中的新生毛細血管增多，降低VEGF的表達能夠抑制毛細血管的新生，可減少供給粘連組織的營養(yǎng)物質(zhì)和氧，從而減少粘連的形成。

盆腔炎性疾病后遺癥患者由于盆腔長期受慢性炎癥刺激，周圍組織增厚、粘連，抗生素難以進入病變部位，因此目前現(xiàn)代醫(yī)學對此無理想的治療方法。大量的臨床報道及實驗研究表明中醫(yī)藥對該病有確切的療效[5-8]。中藥康婦炎膠囊由蒲公英、敗醬草、薏苡仁、赤芍、蒼術(shù)、當歸、川芎、香附、延胡索、澤瀉、白花蛇舌草等組成,其中蒲公英、敗醬草、白花蛇舌草清熱解毒；蒼術(shù)、薏苡仁健脾利濕，清熱排膿；香附、延胡索疏肝理氣止痛；當歸、川芎、赤芍祛瘀養(yǎng)血止痛；澤瀉利水滲濕。諸藥相配，具有清熱解毒、化瘀止痛之功效。本實驗研究結(jié)果表明康婦炎膠囊可明顯改善PID后遺癥模型兔盆腔粘連狀態(tài)，推測其療效機制，可能是通過降低子宮、輸卵管組織粘連因子ICAM-1、TNF-α、VEGF的表達，減輕盆腔組織水腫、炎性滲出及粘連，控制盆腔炎性疾病的病理發(fā)展，促使盆腔炎癥逐漸愈合，且療效優(yōu)于桂枝茯苓膠囊。

[1] 李俊良,劉 恒,王建六,等.兔盆腔炎性疾病后遺癥模型的制備[J].國際婦產(chǎn)科學雜志,2011,38(6):517-519.

[2] 宗 惠.活血補腎法調(diào)控慢性盆腔炎大鼠炎癥細胞因子及粘連相關(guān)指標的實驗研究[J]. 山東中醫(yī)藥大學博士論文,2014.

[3] 陶莉莉,陳小平,傅艷紅,等.腹腔鏡術(shù)后中藥治療對盆腔炎性不孕患者腫瘤壞死因子-α、白細胞介素- 6 的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學學報,2012,29(3):227-230.

[4] 陳小平,陳靚芬,陶莉莉.中藥聯(lián)合腹腔鏡對盆腔炎性不孕患者腫瘤壞死因子α的影響[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2013,34(6):16-19.

[5] 張瑞雪.康婦炎膠囊聯(lián)合保婦康栓治療慢性盆腔炎的臨床療效分析[J].醫(yī)學綜述,2014,20(15):2857-2858.

[6] 劉開敏,張開紅.康婦炎膠囊、血府逐癖膠囊聯(lián)合抗生素治療盆腔炎性疾病后遺癥的療效觀察[J].中國醫(yī)藥指南,2013,11(34):315-316.

[7] 劉 琰.康婦炎膠囊治療慢性盆腔炎療效觀察[J].臨床合理用藥,2014,7(3):63-64.

[8] 曾 維,羅學宏,王小剛.康婦炎膠囊聯(lián)合保留灌腸治療盆腔炎65例[J].陜西中醫(yī),2014,35(3):276-277.

(收稿2015-06-22；修回2015-08-03)

Experimental research on the effects of Kangfuyan capsule on adhesion-related indices in the rabbits with sequelae of pelvic inflammatory disease

Cai Jing He Fengjie Zhu Hongli et al

Affiliated Hospital of Shannxi College of TCM (Xianyang 712000)

Objective: To investigate the mechanism of Kangfuyan capsule treating sequelae pelvic inflammatory disease (PID) by observing the effect of Kangfuyan capsule on adhesion related indexs ICAM-l,TNF-α,VEGF in uterus and fallopian tube of rabbits with sequelae of PID. Method: New Zealand female rabbits with 5 ～ 6 month age were divided into normal group, model group, Guizhifuling capsule group, Kangfuyan capsule group . Except the normal group ,rabbits in other 3 groups were all established the sequelae of PID model by injecting mixture of bacterial suspension into rabbits uterus. Model group, Guizhifuling capsule group ,Kangfuyan capsule group were given distilled water, Guizhifuling capsule, Kangfuyan capsule for 3 weeks respectively after the sequelae of PID models established successfully. The normal group also were given distilled water for 3 weeks. We observed the pelvic,uterus,fallopian tubes situationg of all the rabbits with our naked eyes. HE staining to observe uterus, fallopian tubes pathological changes. Using immunohistochemistry method and western blot to detect the expression of the following indices in uterus and fallopian tubes of rats: ICAM-l,TNF-αand VEGF . Results: In the model group,peritoneal was thickened clearly,pelvic fluid was formed.Uterus were bloodshot,brittle and low elasticity.Fallopian tube walls were rough,thickened, had some adhesion with adjacent tissue,and showed string-of-beads pattern.In Kangfuyan capsule group, peritoneal was not markedly thickened,no pelvic fluid was found, uterus were no congestion, fallopian tubes were no adherence with surround-tissue. Compared with model group expression of ICAM-l,TNF-αand VEGF of Kangfuyan capsule group decreased significantly(P<0.05 orP<0.01). Conclusions : The mechanism of Kangfuyan capsule treating sequelae of PID might be related to that Kangfuyan capsule down regulating the expression of ICAM-l,TNF-αand VEGF in model rabbits.

Pelvic inflammatory disease/ traditional Chinese medicine therapy Animal experimentation Rabbits @Kangfuyan capsule Intercellular adhesion molecule-1 Tumor necrosis factor-alpha Vascular endothelial growth factors

*陜西省教育廳項目(14JK1198)

盆腔炎性疾病/中醫(yī)藥療法 動物實驗 兔 @康婦炎膠囊 胞間粘附分子1 腫瘤壞死因子-α 血管內(nèi)皮生長因子

R711.33

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.048