糖痹康對STZ誘導的DPN大鼠坐骨神經細胞凋亡Drp1信號通路的影響*

易文明 孫 文 郭翔宇 劉銅華▲

北京中醫藥大學東方醫院內分泌科(北京100078)

糖痹康對STZ誘導的DPN大鼠坐骨神經細胞凋亡Drp1信號通路的影響*

易文明 孫 文△郭翔宇 劉銅華△▲

北京中醫藥大學東方醫院內分泌科(北京100078)

目的：探討糖痹康對糖尿病周圍神經病變大鼠細胞凋亡Drp1信號通路的作用機制。方法：使用60只高脂飼料喂養后小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射而誘發的2型糖尿病大鼠動物模型，8周造模成功后按體重隨機分為模型組、α-硫辛酸組、糖痹康低、中、高劑量組，另外單獨設10只大鼠為正常組，模型組和正常組予蒸餾水灌胃，糖痹康組和α-硫辛酸組分別予不同劑量糖痹康和α-硫辛酸灌胃，每4周測一次體重、空腹血糖，16周后取大鼠一側坐骨神經，采用實時熒光定量PCR法檢測大鼠坐骨神經Drp-1、 Bax和 Bcl-2 mRNA表達水平。結果: 與正常組比較，模型組和各治療組Drp-1的表達水平明顯升高，Bax表達顯著增加,Bcl-2表達顯著減少；糖痹康高劑量組Drp-1的表達水平比α-硫辛酸組更低，Bax表達也更減少，而Bcl-2表達則明顯增加。結論: 糖痹康可以抑制Drp1的表達水平，促進抗凋亡基因Bcl-2的表達而抑制促凋亡基因Bax表達，從而具有抗Drp-1信號通路的細胞凋亡作用，緩解DPN的進展。

糖尿病性周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病經常出現的慢性并發癥之一，它很容易造成糖尿病足及截肢,有癥狀的發病率波動在50%～70%，甚至更高，由于診斷方法不統一，有的報道發病率可高達90%以上，基于DPN非常高的發病率和致殘率，DPN的預防和治療已經成為學科內研究的重點領域。目前西藥治療DPN尚缺乏有效手段，而中醫藥治療DPN積累了豐富經驗，療效確切，但作用機制亟待闡明。中藥復方糖痹康是導師劉銅華教授的經驗方，經過了多年的臨床應用，療效較好，目前已獲發明專利(專利申請號：200810167551.1)。本實驗研究是在既往研究的基礎上，選用SPF級SD大鼠，通過高脂飼料喂養后，采用小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射誘發2型糖尿病，構建DPN動物模型[1]。觀察Drp1介導的細胞凋亡信號通路與DPN的關系及糖痹康對其產生的影響，探討糖痹康治療DPN的作用機理，為臨床推廣應用提供理論依據,為以改善神經病變為目的的新藥研發探索新靶點。

1 材 料

1.1 實驗動物 60只純系SPF級SD雄性大鼠，體重(180±20)g，7周齡，從北京維通利華動物實驗中心購買，生產許可證：(SCXR(京)2004—0006)，飼養條件：溫度(23±2)℃、濕度(55±10)%，12/12h 光照黑暗循環，常規攝食飲水，常規喂養1周后用于實驗。

1.2 材料及儀器 糖痹康(主藥為黃芪、桂枝、女貞子、黃連、黃芩等，由北京中醫藥大學中藥學院提供)；α-硫辛酸購于Puritan's Pride公司(100mg×60粒，批號：250597-09 EXP 10/17)；高脂飼料，從北京華阜康生物科技有限公司購買；羅氏活力型血糖儀，ACCU-CHEK；Trizol 試劑(美國 Invitrogen 公司)；逆轉錄試劑盒(加拿大 MBI Fermentas 公司)；定量 PCR 試劑盒(中國 TIANGEN 公司；)Real-Time PCR 儀(美國應用生物儀器公司)；Drp1、Bax、Bcl-2 多克隆抗體(兔)(美國 Santa Cruz 公司)； Unico7200分光光度計。生物電放大器(AVB-10);VC-10(日本光電)記憶示波器，PowerLab 多功能生理信號采樣分析系統，SEN-3201 電刺激器(日本光電)。

2 實驗方法

2.1 模型建立及分組 大鼠常規飼養1周后，按體重隨機選擇10只為正常組，采用普通飼料飼養，其它組大鼠采用高脂飼料喂養，8周后，禁食12h后準備造模，造模用藥物鏈脲霉素用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH4.4)配成1%的濃度，劑量以35mg/kg進行腹腔注射，72h后檢測大鼠血糖值(尾部血管取血)，血糖≥16.7mmol/L以上者視為造模成功，按大鼠體重隨機分為模型組、α-硫辛酸組、糖痹康低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 給藥方法 模型復制成功3d后開始灌胃：糖痹康低劑量組(4.28g/kg)，糖痹康中劑量組(8.56g/kg)，糖痹康高劑量組(17.12g/kg)，α-硫辛酸組：按 20mg/(kg·d)灌胃α-硫辛酸。實驗期間各組大鼠均自由取食、飲水，每天一次，連續給藥16周。

2.3 指標檢測及方法

2.3.1 體重、血糖檢測：灌胃前和灌胃后的第 4、8、12、16周末，禁食6h，稱大鼠體重及檢測血糖。

2.3.2 神經電生理：檢測大鼠右側坐骨神經運動神經傳導速度(MNCV)。常規皮膚消毒，用戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射,大鼠麻醉后，以俯臥位固定好，保持室溫在(20±0.5)℃。運動神經：開始將刺激針電極放置在跺關節內側面，其次放置在坐骨切跡處，波寬為0.1ms，強度為超強刺激，用針電極記錄，保持每2個刺激之間的間隔時間在5s以上。用計算機軟件記錄波幅、潛伏期。反復測定7～10次，算出平均值。掃描速度保持在2ms/cm，記錄頻率3～10000Hz，放大倍數2mv/cm。使大鼠后肢以自然狀態與后背脊柱成45°夾角，然后向斜后方拉直，順著坐骨神經方向，測出大鼠體表兩個刺激點之間的長度，從而計算出MNCV。

2.3.3 實時熒光定量PCR檢測坐骨神經Drp-1,Bax和 Bcl-2 mRNA表達:第16周末，用10%水合氯醛以0.4mg/100g劑量腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，腹主動脈取血放入5mL采血管，4℃靜置2h自然凝固，3000r/min離心15min，取上清，-20℃凍存備用。將大鼠固定于鼠板上，先切開雙側后腿中外l/3處皮膚，接著鈍性分離出肌肉組織，將坐骨神經充分暴露，旁邊肌肉去除，取出盡可能長的坐骨神經，用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，天秤稱其重量后放入凍存管內，于冰壺內冷凍，最后放入-80℃冰箱保存待。用Trizol法提取坐骨神經組織總RNA,紫外分光光度計測定其OD值,通過A260比A280確定RNA純度。電泳法觀察RNA濃度和完整性,RNasin去除基因組DNA。RNA 的反轉錄：各樣本取2μL的RNA,反轉錄合成cDNA。反轉錄反應體系：RNA(2 μg)Primer(oligo-dT)1μL,RNasin抑制劑0.5 μL,5×RT Buffer4μL、dNTP Mix(10 mM each)1μL、RNasein 0.5μL、MMLV反轉錄酶(100 U/μL)1μL,補DEPC 水至終體積20μL。cDNA的熒光定量PCR 擴增：熒光定量Master MIX(含SYBR 熒光染料)27μL,25pmol引物1 μL(實驗中所用引物見表1),總體積30μL。擴增條件：95℃預變性3min,然后95℃ 20s,60℃ 20s,72℃ 30s擴增50 個循環,最后72 ℃延伸5min,55℃～95℃繪制溶解曲線。采用熒光定量PCR 專用分析軟件對結果進行分析。

表1 引物序列

3 結 果

3.1 一般情況 造模72h后，大鼠表現出多食多尿，體重下降，精神萎靡，體毛色澤干枯，活動變得遲緩，在14周后還出現了身體潰瘍等情況，而在α-硫辛酸組和中藥糖痹康高劑量組以上情況出現的較少。

3.2 體重稱量 見表2，和正常組相比，從8周開始，模型組大鼠的體重較前輕度下降(P<0.05)；在16周后，模型組大鼠體重明顯下降。和模型組比較，16周后，糖痹康低、中劑量及α-硫辛酸組體重明顯增加。

3.3 血糖檢測 見表3，和正常組比較，模型組大鼠血糖明顯升高；和模型組比較，干預以后各組大鼠血糖較前都有所改善，其中α-硫辛酸組和糖痹康低劑量組在16周后的有明顯差異，而糖痹康中、高劑量組在4、8、12、16周都有明顯下降。

表2 各組大鼠體重的比較

注：與正常組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與模型組比較,□P<0.01

表3 各組大鼠血糖的比較

注：與正常組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與模型組比較,□P<0.01

3.4 MNCV測定 見表4，和正常組比較，模型組大鼠坐骨神經傳導速度顯著減慢；和模型組比較，糖痹康高劑量組及α-硫辛酸組都能提高糖尿病大鼠坐骨神經傳導速度(P<0.05)，組間比較，糖痹康高劑量組的效果優于α-硫辛酸組(P<0.05)，糖痹康各劑量組間相對比，高劑量組改善效果更佳顯著(P<0.05)，提示糖痹康能夠提高糖尿病大鼠坐骨神經傳導速度。

表4 各組大鼠坐骨神經傳導速度比較

注：與正常組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與模型組比較,□P<0.01

3.5 坐骨神經Drp-1,Bax和 Bcl-2 mRNA表達測定 見表5。基于文獻計算方法，以2-△△Ct值為參照量進行統計，和正常組比較，模型組和各治療組Drp-1的表達水平均明顯升高(P<0.05)；和模型組比較，各治療組Drp-1的表達水平明顯下降(P<0.05)；和α-硫辛酸組比較，糖痹康高劑量組Drp-1的表達水平更低(P<0.05))；和正常組比較，模型組和各治療組Bax表達水平明顯增加(P<0.05),Bcl-2表達水平明顯減少(P<0.05)；與α-硫辛酸組相比，糖痹康高劑量組Bax表達水平明顯減少(P<0.05)，Bcl-2表達明顯增加(P<0.05)，這證明糖痹康高劑量能抑制坐骨神經細胞凋亡，效果優于α-硫辛酸組。

表5 各組大鼠坐骨神經組織Drp-1、Bax、Bcl-2

mRNA水平測定

注：與正常組相比，△P<0.05;與西藥組相比,▲P<0.05

4 討 論

DPN的發病機制目前還不是十分清楚，不能用單一因素來解釋，而應該是多種因素相互作用的結果。其可能發病機制主要包括代謝原因和血管原因，還有多元醇途徑、晚期糖基化終末產物(AGEs)途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑、氨基已糖途徑、生長因子缺乏、氧化應、神經營養因子、免疫因素等等。

有研究證實動力相關蛋白-1(dynamin-related protein 1，Drp1)與神經性病密切相關，對糖尿病周圍神經功能損傷起著核心作用，Drp1大多出現在細胞漿，表現為多聚體的形式[2]。Drp-1介導的線粒體裂解是細胞內線粒體內生物合成的關鍵步驟，有研究發現過度表達的Drp-1蛋白會推進線粒體的自身裂解，從而產生很多碎片，而減少Drp-1表達，減少線粒體的裂解，這表明Drp-1可能是線粒體裂解的必需分子[3]。另外，如果神經細胞胞漿中Drp-1過度表達，會轉移到線粒體，并立即激活Caspase系統，導致線粒體內重要蛋白及細胞器受損，最終導致線粒體裂解，引起細胞凋亡[4]。Bcl2 是一種從小鼠 B 淋巴細胞瘤中分離出來的原癌基因，是抑制細胞凋亡的主要基因,Bax與 Bcl2來源相同，它起到幫助定位的作用，它能夠招集大量的Drp1 移動到線粒體表面，大大增強了分裂活性，它是促進細胞凋亡的主要基因，二者相互拮抗，在細胞凋亡中發揮各自重要作用，Drp-1可能通過影響Bax和Bcl2導致細胞凋亡，引起DPN發病[5]。

本動物實驗的目的在于觀察Drp-1與DPN的關系以及糖痹康對其產生的影響，結果提示:糖尿病性周圍神經病變大鼠坐骨神經中Drp-1含量是升高的，這會引起線粒體裂解增加，從而相應地導致Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，促進細胞凋亡。因此，增高的Drp-1水平可能是引起糖尿病性周圍神經病變發病的一個重要原因。而中藥復方糖痹康可以抑制Drp-1的表達水平，促進抗凋亡基因Bcl-2的表達而抑制促凋亡基因Bax表達，因此我們認為，糖痹康具有的抗Drp-1信號通路細胞凋亡作用可能是其對糖尿病周圍神經病變的神經保護作用機制之一。

[1] 吳 晏,韓 靜,黃黎明,等.高脂喂養合并小劑量鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型[J].中國實驗動物學報,2012,20(2):11-15.

[2] Ferrari L F,Chum A,Bogen O,et al.Role of Drp1,a Key Mitochondrial Fission Protein,in Neuropathic Pain[J].Journal of Neuroscience,2011,31(31): 11404-11410.

[3] Thilo F,Suess O,Liu Y,et al.Decreased expression of transient receptor potential channels in cerebral vascular tissue from patients after hypertensive intracerebralhemorrhage[J].ClinExpHypertens,2011,33(8): 533-537.

[4] Chasman D I,Schurks M,Anttila V,et al.Genome-wide association study reveals three susceptibility loci for common migraine in the general population[J].Nat Genet,2011,43(7): 695-698.

[5] Castiglioni A J,Remis N N,Flores E N,et al.Expression and vesicular localization of mouse Trpml3 in striavascularis,hair cells,and vomeronasal and olfactory receptor neurons[J].J Comp Neurol,2011,519(6): 1095-1114.

(收稿2015-01-22；修回2015-03-11)

*北京中醫藥大學自主選題項目(2013-JYBZZ-JS-159)

北京中醫藥大學創新團隊項目(2011-CXTD-19)

教育部中醫養生學重點實驗室項目

北京市中醫養生學重點實驗室項目

△北京中醫藥大學(北京 100029)

▲通訊作者

糖尿病并發癥 糖痹康 Drp1 Bax Bcl-2 細胞凋亡

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.06.057