豬LTβR基因克隆、結構功能預測、組織表達譜分析及真核表達載體構建

吳正常，戴超輝，殷學梅，孫壽永，2，包文斌，2*，吳圣龍，2*

(1.揚州大學動物科學與技術學院 江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009；2.江蘇省種豬繁育和健康養殖工程技術研究中心，揚州 225009)

豬LTβR基因克隆、結構功能預測、組織表達譜分析及真核表達載體構建

吳正常1，戴超輝1，殷學梅1，孫壽永1，2，包文斌1，2*，吳圣龍1，2*

(1.揚州大學動物科學與技術學院 江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，揚州 225009；2.江蘇省種豬繁育和健康養殖工程技術研究中心，揚州 225009)

為了進一步探究豬LTβR基因的生物學功能，本研究以豬淋巴組織cDNA為模板擴增LTβR基因CDS區，進一步利用生物信息學對豬LTβR蛋白結構與功能以及參與的GO和Pathway通路進行分析，利用Real-time PCR檢測LTβR基因在大白豬不同組織中的表達水平，同時將LTβR基因擴增產物克隆至真核表達載體pEGFP-C1中，并分別轉染豬HEK293和IPEC-J2小腸上皮細胞系，通過顯微鏡觀察其表達情況。結果表明，克隆獲得豬LTβR基因CDS區全長為1 209 bp，編碼402個氨基酸，發現LTβR為脂溶親水性的不穩定蛋白，存在1個跨膜結構(205～227 aa)，不存在信號肽，亞細胞定位表明LTβR為非分泌型蛋白。LTβR蛋白具有2個糖基化位點，18個潛在的磷酸化位點，其中包括PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10種保守的特異性蛋白質激酶的結合位點。該蛋白保守區域為2個TNFR superfamily，分別位于32～125和128～192位氨基酸，并發現C422T>A141V突變位于該區域內。KEGG和GO分析發現，LTβR基因共參與12項GO功能分類，同時還參與NF-kappa B信號通路、IgA 合成的腸道免疫網絡等5項調控通路。定量檢測發現，LTβR基因在大白豬肺中的表達水平極顯著高于其他組織(P<0.01)，在腎和脾等免疫器官，十二指腸和空腸等腸道組織中也均有較高的表達水平。細胞水平轉染試驗及顯微鏡觀察發現其在豬HEK293和IPEC-J2兩種細胞中均表達。本研究為豬LTβR基因及其介導的信號通路的功能分析提供了材料和依據，今后有必要在細胞水平上進一步驗證分析豬LTβR基因及其介導的信號通路在豬抵抗細菌感染過程中發揮的重要作用，同時將C422T突變作為豬抗病育種的一個潛在遺傳標記進行系統分析。

豬；LTβR基因；克隆；真核表達載體；蛋白結構與功能

腸道是動物防止感染的第一道防線，腸道內各種免疫成分為其提供多方面、多層次的防護，構成了嚴密的免疫屏障，這就是腸道免疫系統，也叫黏膜免疫系統。腸道免疫系統是由免疫細胞、免疫球蛋白(IgA)及腸道微生物組成，其中豬腸道系統功能中起關鍵作用的是由B細胞轉化為漿細胞后產生的IgA，它是腸道免疫屏障的一個重要組成部分，同時對腸道菌群也有調節作用。淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)是淋巴細胞受抗原或有絲分裂原等刺激活化后及在某些腫瘤、自身免疫病的情況下分泌的一種細胞因子，分為LTα和LTβ兩種亞基。學者利用LTα-/-的小鼠模型揭示，LTα基因在淋巴組織生成中發揮了重要作用[1]，T.Shimazu等成功克隆出豬脾的LTβ基因，并初步認為LTβ基因在初生仔豬的小腸免疫系統發育中發揮了重要作用[2]，因此分析LTβ基因受體的功能及作用機制顯得尤為重要。

淋巴毒素β受體(LTβR)，又名腫瘤壞死因子受體超家族成員(TNFRSF3)，是一個富含半胱氨酸，具有類似腫瘤壞死因子受體結構域的膜蛋白。LTβR基因在淋巴器官的形成過程中，如腸系膜淋巴結的形成及次級淋巴結構和功能重建中，起著非常重要的作用[3-4]。研究報道，LTβR敲除小鼠體內血漿和腸道IgA顯著減少，同時LTβR-/-小鼠缺乏所有的淋巴組織，包括結腸相關淋巴結，脾邊緣區丟失，B/T細胞分離以及濾泡樹突狀細胞缺失等[5]。現有研究表明，可溶性的淋巴毒素α(s-LTα3)以及膜結合淋巴毒素β(LTαβ2)可以誘導IgA的生成，從而支持機體的免疫反應。LTβR是腸道IgA產生所必需的，W.Kang等發現，LTβR信號通路對腸道固有層細胞因子的適度表達以及對產生IgA的漿細胞的歸巢起著重要的作用[6]；此外，H.Guo等[7]利用疾病相關的eQTL定位結合貝葉斯定理篩選出6個免疫疾病調控相關基因，其中就包括LTBR基因。以上研究表明，LTβR基因對腸道免疫中IgA調控以及機體免疫疾病起關鍵作用。目前有關豬LTβR基因的序列、表達模式以及結構功能等研究相對較少，本研究根據GenBank數據庫公布的豬LTβR基因序列(來源于電子克隆)進行mRNA分子克隆，在此基礎上利用生物信息學分析豬LTβR蛋白序列特征，構建LTβR真核表達載體并進行細胞轉染試驗，同時進行LTβR基因的組織表達譜分析，旨在探討豬LTβR基因的結構與功能，同時也為下一步細胞水平上的功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選取的8頭35日齡大白斷奶仔豬來自常州康樂農牧有限公司(國家生豬核心育種場)，屠宰后取11個組織樣(心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺、淋巴結、十二指腸和空腸組織)，現場液氮保存，然后轉移至-70 ℃冰箱備用。采用Trizol法提取總RNA，并利用NanoDrop 1000 Spectrophotometer(NanoDrop Technologies，Inc.，Wilmington，DE，USA)測定其OD值，并對OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0的進行總RNA反轉錄，合成cDNA。

1.2 生化試劑

質粒小量快速提取試劑盒、切膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)；T4連接酶和限制性內切酶均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；脂質體LipofectaInineTM2000購自Invitrogen公司(美國)。DL2000 marker、pMD19-T載體、Trizol和反轉錄試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；pEGFP-C1載體購自Clontech公司(Canada，Catalog#6084)；JM110感受態細胞購自深圳市百恩維生物科技有限公司，DH5α感受態細胞、HEK293和IPEC-J2小腸上皮細胞由本實驗室保存。

1.3 目的基因克隆及真核載體構建

根據GenBank數據庫中豬LTβR序列(GenBank登錄號：XM_005653161.1)，采用Primer 5.0軟件設計克隆引物，引物序列為上游：5′-CCTCCCATCTTCCTCCCAGG-3′，下游：5′-GGCTTC-TCCCAGACACCATC-3′，以豬淋巴組織cDNA為模板擴增LTβR基因，預期擴增片段大小為1 376 bp。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收后，克隆至pMD19-T載體上，連接產物轉化為DH5α感受態細胞，瓊脂平板培養菌落，37 ℃培養過夜。經PCR初步鑒定為陽性的菌液送往生工生物工程(上海)有限公司測序鑒定。

1.4 真核重組表達質粒的構建和鑒定

將測序正確的陽性克隆擴大培養，提取pMD19-T-LTβR重組質粒用xbaⅠ和AccⅠ雙酶切克隆到pEGFP-C1載體，回收目的片段經純化回收后，在T4 DNA連接酶作用下4 ℃連接過夜。連接產物轉化至JM110感受態細胞中，涂布于含氨芐青霉素(100 μg·mL-1)LB平板，37 ℃倒置培養過夜。挑取單克隆搖菌提取質粒，進行雙酶切鑒定并測序。

1.5 細胞培養及轉染

利用普通質粒小抽試劑盒抽提重組質粒，豬HEK293和小腸上皮細胞系IPEC-J2分別在2 mL完全培養液(F12∶DMEM=1∶1，10%胎牛血清)進行培養，培養條件為37 ℃、5% CO2。按照1.0×106個·孔-1的密度接種于6孔板，培養至70%～80%時進行轉染處理。參照脂質體LipofectaInineTM2000說明書，轉染24 h后顯微鏡觀察。

1.6 生物信息學分析

利用生物信息學手段分析LTβR蛋白的基本理化性質、基本結構、功能位點和區域，分別利用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)進行LTβR蛋白的基本理化性質(氨基酸組成、分子量以及等電點等)分析； SignalP4.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行蛋白的信號肽分析；TMHMM 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行跨膜分析；Anthepro蛋白分析軟件基于Garnier方法進行蛋白的二級結構分析；在線軟件NetNGlyc(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析LTβR蛋白糖基化位點；NetPhos(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析潛在磷酸化位點；NetPhosK 1.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/)分析保守的特異性蛋白激酶作用位點；利用PSORTⅡPrediction(http：//psort.hgc.jp/)分析蛋白亞細胞定位；利用NCBI的CDD數據庫[8]分析LTβR蛋白的功能結構域；利用KEGG和GO數據庫分析LTβR基因所參與的GO功能和pathway通路。

1.7 豬LTβR基因組織表達譜檢測

根據克隆的豬LTβR和已發表的GAPDH基因序列[9-10]設計熒光定量引物，采用Primer express 2.0 軟件設計引物，LTβR基因上游引物：5′-GAAC-CACCTCTCCATCTGCC-3′，下游引物：5′-GTCCCAGAAGACGCAGAACA-3′，預期擴增片段長為133 bp；內參GAPDH基因上游引物：5′-ACATCATCCCTGCTTCTACTGG-3′，下游引物：5′-CT-CGGACGCCTGCTTCAC-3′，預期擴增片段長為187 bp，所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。熒光定量PCR反應體系為20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.4 μL，SYBR Green Real time PCR Master Mix(2×) 10 μL，ddH2O 7.8 μL。PCR反應條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 15 s；62 ℃ 34 s，40個循環；4 ℃保存，擴增結束后分析熔解曲線。運用熔解曲線上是否具有(85±0.8)℃ Tm峰來判斷PCR擴增的單一性，采用相對定量的方法計算每個組織的表達水平，相對定量的結果采用2-ΔΔCt法[11]進行處理，2-ΔΔCt法計算公式：ΔΔCt =(待測組目的基因平均Ct值-待測組看家基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組看家基因平均Ct 值)，即每一個組織目標基因表達經內參均一化處理后相對于某個組織的倍數。每份樣本進行3次實時PCR檢測，取平均值。

2 結 果

2.1 豬LTβR基因CDS擴增及克隆測序

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得單一目的條帶，與預期擴增的片段大小(1 376 bp)一致，見圖1A，將克隆產物與pMD19-T載體連接，送往上海生工生物工程有限公司進行測序。測序結果顯示，該克隆的LTβR基因包含1 209 bp的CDS序列，編碼402個氨基酸(圖2)；Blast分析顯示，該克隆所包含的大白豬LTβR基因cDNA序列與GenBank提供的預測序列同源性達99.85%，并發現兩處突變位點，分別為錯義突變C422T(A141V)和沉默突變A432G，見圖3。

2.2 重組質粒雙酶切鑒定及細胞轉染

用xbaI 和AccI雙酶切pEGFP-C1-LTβR重組質粒及空載體，雙酶切鑒定后測序，連接正確的即為陽性克隆(圖1B)。pEGFP-C1-LTβR重組質粒分別轉染豬HEK293和IPEC-J2小腸上皮細胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察可見靶細胞發出綠色熒光(圖4)，這表明通過重組表達質粒轉導入細胞的LTβR過表達片段均可在兩類細胞中有效表達，且HEK293細胞轉染效率較高。

A.豬LTβR基因CDS區擴增圖：M.DNA相對分子質量標準DL2000；1、2.LTβR基因編碼區的擴增產物。B.PEGFP-C1-LTβR重組質粒的雙酶切圖：M.DNA相對分子質量標準DL5000；1.重組質粒的擴增產物；2、3.重組質粒PEGFP-C1-LTβR經酶切后的產物；4、5.LTβR基因編碼區擴增產物A．The clone CDS result of pig LTβR gene：M.DL2000 marker；1 and 2.The amplification products of LTβR CDS sequence.B.The endonucleases digestion of PEGFP-C1-LTβR：M.DL5000 marker；1.The amplification product of PEGFP-C1-LTβR；2 and 3.The products after endonucleases digestion of PEGFP-C1-LTβR；4 and 5.The amplification products of LTβR CDS sequence圖1 LTβR基因擴增產物及雙酶切鑒定Fig.1 PCR products and endonucleases identification of LTβR gene

2.3 豬LTβR蛋白的基本理化性質和結構分析

利用在線軟件分析發現，豬LTβR蛋白分子式為C1897H2952N534O586S32，分子質量約為43.64 ku，原子總數為6 001個，理論等電點pI為5.42，帶正電荷和負電荷的氨基酸殘基數分別為29和46個。蛋白質中脂肪鏈氨基酸含量表示脂溶指數(Aliphatic index)，主要由Leu、Ile和Val組成，可以代表蛋白的穩定性，本研究發現LTβR蛋白脂溶指數為34.59，表明該蛋白是脂溶性蛋白。不穩定系數(Instability index)為49.92(>40)，表明該蛋白不穩定。總平均親水性(GRAVY)為-0.433，表明該蛋白為親水性蛋白。豬LTβR蛋白最大疏水性位于第218位氨基酸，最大親水性位于第29位氨基酸，整體來看親水性區域大于疏水性(圖5)；豬LTβR蛋白中205～227位氨基酸之間含有一個跨膜結構，228～402位氨基酸屬于胞內區，其余的為胞外區(圖6)；豬LTβR蛋白不存在信號肽，表明為非分泌蛋白；蛋白二級結構包括α螺旋(Alpha helix)73個，百分比為18.16%，β延伸鏈(Extended strand)66個，百分比為16.42%，無規則卷曲(Random coil)263個，百分比為65.42%。

圖2 豬LTβR基因編碼序列及其編碼氨基酸序列Fig.2 The coding sequence and amino acid sequence of pig LTβR

圖3 豬LTβR基因編碼區SNPs位點篩查Fig.3 Screening of SNP sites in pig LTβR CDS

A、B分別代表了pEGFP-C1-LTβR質粒侵染HEK293、IPEC-J2小腸上皮細胞熒光顯微鏡觀察結果；左圖表示熒光視野下的圖片，右圖表示可見光視野下的圖片A，B represent fluorescence microscope observation of HEK293 and IPEC-J2 intestinal epithelial cells infected by pEGFP-C1-LTβR，respectively；left figures represent the photos under the view of fluorescence，right figures represent the photos under the view of visible light圖4 LTβR重組質粒侵染HEK293和IPEC-J2小腸上皮細胞熒光顯微鏡觀察 100×Fig.4 Fluorescence microscope observation of HEK293 and IPEC-J2 intestinal epithelial cells infected by LTβR recombinant plasmid 100×

圖5 豬LTβR蛋白的親/疏水性分析Fig.5 Hydrophilic/hydrophobic analysis of pig LTβR protein

2.4 豬LTβR蛋白的功能分析

在線軟件分析可知，豬LTβR蛋白存在2個糖基化位點，分別位于第21和158位氨基酸(圖7)；該蛋白存在18個潛在的磷酸化位點，包括5個Ser、9個Thr和4個Tyr(圖8)，上述磷酸化位點所對應的磷酸激酶預測結果顯示，在LTβR蛋白上可能有PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10種保守的特異性蛋白激酶的結合位點(表1)，其中在226位處PKC分值最高為0.90。亞細胞定位結果顯示，豬LTβR蛋白69.6%可能存在于細胞核內，13.0%可能存在質膜上，8.7%可能存在細胞質內，4.3%可能存在高爾基體內，由此進一步推測該蛋白可能為非分泌型蛋白。

圖6 豬LTβR蛋白的跨膜結構分析Fig.6 Transmembrane structure analysis of pig LTβR protein

圖內橫線代表閾值；豎線代表潛在糖基化位點；數字代表氨基酸位置In the figure，abscissa indicate threshold；Vertical line indicate the potential glycosylation sites，number on vertical line indicate the position of amino acids圖7 豬LTβR蛋白的糖基化位點預測Fig.7 Prediction of glycosylation sites of pig LTβR protein

橫線代表閾值；各條豎線分別代表潛在的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點；絲氨酸位點.68、160、161、256、305；蘇氨酸位點.47、59、95、98、133、185、190、281、380；酪氨酸.32、69、341、365Abscissa line indicate threshold；Vertical lines indicate potential tyrosine，serine and threonine phosphorylation sites，respectively；Serine sites.68，160，161，256，305；Threonine sites.47，59，95，98，133，185，190，281，380；Tyrosine sites.32，69，341，365圖8 豬LTβR蛋白的磷酸化位點預測Fig.8 Prediction of phosphorylation sites of pig LTβR protein

豬LTβR蛋白含有2個TNFR(Tumor necrosis factor receptor)超級家族保守結構域，1個位于32～125位氨基酸，預測評估值E-value為6.16e-28，另一個位于128～192位氨基酸，預測評估值E-value為1.62e-07，該保守結構域由50’s環TNF結合位點(50’s loop TNF binding site)、90’s環TNF結合位點(90’s loop TNF binding site)和3個不同蛋白多肽結合位點5個部分組成。KEGG與GO分析發現，LTβR基因參與分子功能(3個)、細胞組成(1個)以及生物過程(8個)等共12項GO功能分類(表2)，同時還參與細胞因子受體相關作用、NF-kappa B信號通路、IgA 合成的腸道免疫網絡等5項重要的調控通路(表3)。

表1 豬LTβR保守的特異性蛋白激酶作用位點

Table 1 Conserved and specific phosphkinase binding sites in pig LTβR protein

項目Item絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸Serine/Threonine/Tyrosine激酶KinasePKCCKICKIICDC2DNAPKGSK3CDK5ATMINSRSRC位點Site98、190、2266868、133256689595、161、380305341365

表2LTβR基因參與的GO功能分析

Table 2 GO function analysis ofLTβRgene

GO分類GOclassificationGO編號GOIDGO具體名稱QualifiedGOterm分子功能MolecularfunctionGO：0005515蛋白結合ProteinbindingGO：0031625泛素連接酶結合UbiquitinproteinligasebindingGO：0042802同類蛋白結合Identicalproteinbinding細胞組成CellularcomponentGO：0016021完整膜結構Integralcomponentofmembrane生物過程BiologicalprocessGO：0006915凋亡過程ApoptoticprocessGO：0007165信號轉導SignaltransductionGO：0016032病毒過程ViralprocessGO：0019048病毒形態或者生理機能調節ModulationbyvirusofhostmorphologyorphysiologyGO：0043123I?kappaB激酶/NF?kappaB信號的正調節PositiveregulationofI?kappaBkinase/NF?kappaBsignalingGO：0046330JNK級聯的正調節PositiveregulationofJNKcascadeGO：0071260機械刺激的細胞反應CellularresponsetomechanicalstimulusGO：2001238體外凋亡信號通路的正調節Positiveregulationofextrinsicapoptoticsignalingpathway

表3LTβR基因參與的Pathway分析

Table 3 Pathway analysis ofLTβRgene

通路編號PathwayID通路名稱Pathwaytermmap04060細胞因子受體相互作用Cytokine?cytokinereceptorinteractionmap04064NF?kappaB信號通路NF?kappaBsignalingpathwaymap04066HIF?1信號通路HIF?1signalingpathwaymap04672IgA合成的腸道免疫網絡調控通路IntestinalimmunenetworkforIgAproductionmap05166HTLV?I感染HTLV?Iinfection

2.5 豬LTβRmRNA組織表達特異性

所提取組織的總RNA經2.2%甲醛變性凝膠電泳檢測，無明顯降解條帶及DNA污染條帶，ND-1000核酸/蛋白濃度測定儀測定RNA的A260 nm/ A280 nm為1.8～1.9，說明RNA提取質量較高可用于后續試驗。組織表達譜檢測結果發現(圖9)，LTβR基因在肺中表達水平極顯著高于其他組織(P<0.01)，其次為肝、腎和脾等免疫器官，十二指腸和空腸等腸道組織中也有一定的表達。

1～11分別表示心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺、淋巴、十二指腸和空腸；不同組織間上標包含不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)1-11 represent heart，liver，spleen，lung，kidney，stomach，muscle，thymus，lymphatic，duodenum and jejunum；Superscript between different tissues containing different capital letters mean significant difference (P<0.01)，different small letters mean significant difference(P<0.05)圖9 LTβR在各組織中的表達分析Fig.9 Expression analysis of LTβR in different tissues

3 討 論

本研究成功克隆得到大白豬LTβR基因全長CDS區(長度為1 209 bp)，共編碼402個氨基酸，沒有檢測到不同的可變剪接。與人、小鼠LTβR比對發現，氨基酸同源性分別為70.3%和66.9%。LTβR表達很廣泛，主要表達在初級和次級淋巴樣組織，以及肺、腎等內臟器官，外周血沒有表達。很多貼壁細胞的原代細胞系(如HEK293、HT-29、U937等)中都能檢測到它的表達，本研究成功構建了真核表達載體PEGFP-C1-LTβR，并通過轉染熒光檢測進一步證實了LTβR基因在豬HEK293細胞中具有較高的表達，同時也發現它在豬小腸上皮細胞IPEC-J2中也有表達。組織表達譜檢測發現，LTβR基因在豬肺、腎以及脾等免疫器官中高表達，同時在十二指腸和空腸等腸道組織中也有較高水平的表達。LTβR能夠分別特異性地結合LTα和LTβ形成異源三聚體LTα1β2和LIGHT兩種配體，在生物體內發揮著不同的生物學功能[12-14]。LTα1β2主要表達在T淋巴細胞表面，通過與間質細胞表面的LTβR結合，參與次級淋巴器官和脾的發育。LTβR與LIGHT結合可誘導腫瘤細胞的凋亡，產生各種細胞因子，在腸系膜淋巴結的形成以及次級淋巴結結構和功能重建過程中起著重要作用，并且研究發現LIGHT是參與調節腸道炎癥中不可缺少的物質[15]。鑒于LTβR在免疫器官形成和腸道免疫調控中發揮的作用，本研究從蛋白功能位點和保守區域進一步分析其作用機制，發現豬LTβR蛋白存在2個腫瘤壞死因子受體TNFR超家族保守域，分別位于第32～125和128～192位氨基酸，已有研究發現，TNFR家族蛋白在不同生物系統中細胞凋亡或者程序性細胞死亡中發揮重要的作用[16-18]，TNFR區域作為LTβR蛋白主要的功能區域，而本研究發現了1處突變C422T>A141V位于TNFR功能區域，可能對LTβR蛋白功能造成一定的影響，因此C422T突變可能作為今后重點研究LTβR基因作為豬抗病育種的一個潛在遺傳標記。

LTβR基因作為腫瘤壞死因子的家族成員，有關學者對其介導的信號通路在細菌微生物感染導致的宿主免疫應答中的重要作用做了大量的研究。目前，利用融合蛋白LTβR-IgG體內阻斷LTβR介導的信號通路，是一種常用的研究其生物學功能的手段[19]。R.Lucas等利用牛分枝菌卡介苗(BCG)感染野生型小鼠和LTβR-IgG處理后的小鼠，發現LTβR信號通路的阻斷抑制了處理組小鼠巨噬細胞的激活和iNOS合成的活性，從而導致小鼠脾的肉芽腫生成數目減少，這表明LTβR信號通路在牛分枝菌卡介苗感染中對Th1型免疫應答起著重要的促進作用[20]。LTβ-/-小鼠和野生型小鼠分別感染單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，發現處理小鼠對細菌呈現出了顯著的易感性[21]。LTβR介導的信號通路在大腸桿菌等革蘭陰性菌，嚙齒枸櫞酸桿菌(Citrobacter rodentium)引發的傳染性結腸炎中也發揮了重要作用[22]。總的來說，阻斷LTβR介導的信號通路會導致宿主在細菌感染后清除細菌的免疫機能受到嚴重損壞。此外，LTβR-IgG處理的小鼠對鼠巨細胞(MCMV)病毒的易感性增強，導致死亡率增高[23]。本研究分析發現，LTβR共參與5個信號通路即細胞因子受體相關作用、NF-kappa B信號通路、HIF-1信號通路、IgA 合成的腸道免疫網絡調控通路和HTLV-I感染。LTβR與LTα1β2和LIGHT結合后可以激活NF-kappa B信號通路，并引起腸道淋巴形成等免疫調控[12-14]，因此，LTβR介導的NF-kappa B信號通路和IgA 合成的腸道免疫網絡調控通路顯得尤為重要。本研究成功構建了LTβR基因真核表達載體，并在豬HEK293和IPEC-J2細胞中檢測到其表達，今后可以進一步開展過表達以及RNA干擾試驗，此外目前最流行的基因定點修飾技術-CRISPR/Cas9已經成功應用于細菌、人類細胞、斑馬魚、小鼠、豬、食蟹猴以及多種植物的基因組精確修飾[24]，也可以結合CRISPR/Cas9基因敲除試驗從細胞水平上更加全面地分析LTβR介導的信號通路在豬抗細菌感染中的作用機制，為今后從提高機體免疫能力的角度來進行分子選育與抗病育種提供指導和依據。

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(編輯 郭云雁)

Gene Cloning，Prediction of Structure and Function，Analysis of Tissue Expression Profile and Construction of Eukaryotic Expression Vector of PigLTβRGene

WU Zheng-chang1，DAI Chao-hui1，YIN Xue-mei1，SUN Shou-yong1，2，BAO Wen-bin1，2*，WU Sheng-long1，2*

(1.KeyLaboratoryforAnimalGenetics，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.JiangsuEngineeringResearchCenterfortheReproductionandHealthyBreedingofBoar，Yangzhou225009，China)

In order to further explore the biological function of pigLTβRgene，the coding sequence(CDS) ofLTβRgene was amplified from the cDNA of porcine lymphoid tissue and the protein structure and function，GO function，regulatory pathways of porcine LTβR were further analyzed by bioinformatics tools.Real-time PCR was used to detect the expression level of porcineLTβRgene in different tissues of Yorkshire.MeanwhileLTβRgene was cloned into the eukaryotic expression vector pEGFP-C1，then transfected into HEK293 cell and small intestinal epithelial cell IPEC-J2，respectively.The expression of recombinant plasmid was detected in both cells through microscopic observation.The results showed that the pigLTβRcDNA full length was 1 209 bp encoding 402 amino acids.LTβR was a fat-soluble，hydrophilic and unstable protein，containing a transmembrane structure between 205 and 227 amino acids，meanwhile no signal peptide and subcellular localization indicated that LTβR protein was non-secretory.LTβR protein had 2 glycosylation sites，18 potential phosphorylation sites including 10 conservative binding sites of specific protein kinase such as PKC，CKI，CDC2，GSK3，CDK5，INSR，etc.Pig LTβR protein had 2 conservative domains named TNFR superfamily，which were located in the region between 32 and 125 amino acid，between 128 and 192 amino acid，respectively.Besides the mutation C422T>A141V occurred in the conservative domain.KEGG and GO analysis showedLTβRgene participated in 12 GO function classifications，5 regulatory pathways such as NF-kappa B signaling pathway，intestinal immune network for IgA production，etc.Real-time PCR analysis showed the expression level ofLTβRgene in Yorkshire lung tissue was very significantly higher than other tissues(P<0.01).Moreover，LTβRgene was also highly expressed in both pig immune organs such as kidney，spleen and intestinal tissue such as duodenum，jejunum.Transfection experiments and microscopic observation showed the pEGFP-C1-LTβR recombinant plasmid was expressed in both HEK293 and IPEC-J2 cells.This study will provides materials and basis for studying the function ofLTβRgene and LTβR-mediated signaling pathways，therefore it is necessary to further verify and analyze the regulatory mechanism and important role ofLTβRgene and signaling pathways at cellular level，meanwhile we should systematically analyze the mutation C422T as a potential genetic marker for pig disease-resistant breeding.

pig；LTβRgene；cloning；eukaryotic expression vector；structure and function of protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.003

2015-01-07

轉基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX08006-001B)；國家自然科學基金(31372285；31172183)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)

吳正常(1987-)，男，江蘇南京人，博士生，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：wuzhengchang@126.com

*通信作者：包文斌，研究員，博導，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：wbbao@yzu.edu.cn；吳圣龍，研究員，博導，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：slwu@yzu.edu.cn

S828；S813.3

A

0366-6964(2015)12-2135-11