金柑DNA結合蛋白的分離及染色質體外組裝研究

李夢蕓，李光鋒,2，楊 華，黎子云，吳小平，饒力群

（1. 湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128；2. 湖南食品藥品職業學院，湖南長沙410208）

金柑DNA結合蛋白的分離及染色質體外組裝研究

李夢蕓1，李光鋒1,2，楊 華1，黎子云1，吳小平1，饒力群1

（1. 湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128；2. 湖南食品藥品職業學院，湖南長沙410208）

為了研究DNA與DNA結合蛋白的相互作用，以及無細胞的染色質體外組裝過程，從金柑葉片中提取總DNA，利用微晶纖維素得到DNA-纖維素層析配體，經DNA-纖維素層析分離得到DNA結合蛋白，再將純化的DNA和DNA結合蛋白在低鹽條件下按一定比例混合，并進行電鏡觀察。結表表明，該混合物產生絮狀沉淀，電鏡觀察發現念珠狀的小黑圓點，因此推測DNA和DNA結合蛋白發生互作，可能形成核小體引起染色質體外組裝。

金柑；DNA結合蛋白；纖維素層析；體外組裝

在真核生物細胞核中，染色質是由DNA和組蛋白一起被壓縮成一個高度有序的結構，以核小體為基本結構單位。由146 bp的DNA 圍繞一個八聚體的組蛋白（兩分子的H2A-H2B二聚體，兩分子的H3和兩分子的H4）形成核小體的核心結構，核小體之間由組蛋白H1與DNA結合，并經過進一步的折疊纏繞及自我組裝形成染色質高級結構[1-4]。然而，高度致密的染色質結構會影響DNA的復制、重組、鏈裂解、轉錄和修復等[5-7]，調節染色質的結構是真核基因表達調控的關鍵步驟。在染色體水平上研究蛋白質與DNA的相互作用過程能有效地反映體內蛋白質調控基因表達的真實狀況。

序列特異性DNA結合蛋白（Sequence-specifc DNA binding proteins) 能與DNA上特定的靶位點相互作用，從而在基因的表達和DNA復制、重組等過程中進行調控，與細胞周期中染色體的一系列變化相關，包括組蛋白、轉錄因子、單鏈結合蛋白、解鏈酶、DNA聚合酶以及RNA聚合酶等[8]。呂湘等[9]研究表明，DNA結合蛋白與DNA、組蛋白先形成復合物，再通過招募染色質重塑復合物，可引起染色質重塑，而應用不同的組裝因子也可將DNA模板組裝成適當的染色質結構[10]。

本研究通過提取真核細胞DNA結合蛋白，與基因組DNA相互作用，建立起無細胞的染色質體外組裝，以期為進一步研究如何改變染色體空間構象和引起基因的激活或抑制轉錄提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試材的處理

挑選長勢相近的1年生金柑（Fortunella margarita (Lour.) Swingle），摘取葉片若干，保存于－80℃超低溫冰箱中，備用。

1.2 方法

1.2.1 金柑葉片蛋白質的提取 用液氮將30 g金柑葉片研磨成粉末；加入100 mL蛋白質提取液[20 mmol/L Hepes (pH值 7.5)，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 mol/ L NaCl，0.2 mmol/L EDTA，25%甘油，0.5 mmol/L DTT，0.2 mmol/L PMSF]，充分混勻；4℃條件下浸提2 h，12 000 r/min離心20 min；上清液即為金柑葉片蛋白質溶液。

1.2.2 DNA-纖維素層析分離DNA結合蛋白 將層析管中裝入纖維素晶粉固定的雙鏈化DNA，先用0.1 mol/L NaCl溶液平衡；再用5 mL金柑葉片蛋白質溶液上柱，仍用0.1 mol/L NaCl溶液洗脫；待洗凈雜質后，改用1 mol/L NaCl溶液洗脫。按2 mL每管進行收集，同時用紫外可見分光光度計測定吸光度，直至流出液的吸光度回歸基線，將洗脫獲所得的DNA結合蛋白混合備用[11-12]。

1.2.3 蛋白質SDS-PAGE電泳 蛋白質樣品和DNA結合蛋白混合樣品均加入5倍樣品緩沖液中混勻，沸水浴5 min，離心并等量點樣，采用4%濃縮膠及12.5%分離膠進行不連續垂直平板電泳，掃描拍照，使用PDQuest 1-D軟件對圖像進行分析處理。

1.2.4 DNA結合蛋白的酶解及質譜鑒定 參照考王鴻麗[13]和廖翔[14]的研究方法進行。

1.2.5 染色質體外組裝 取1.2.2中經1 mol/L NaCl洗脫收集得到的蛋白質溶液1 mL，加入濃度OD260為10的金柑葉片DNA溶液50 μL，溫和混勻，4℃靜置3 h，再加入9 mL 0.01 mol/L的EDTA溶液，溫和混勻，4℃靜置，并觀察直至絮狀的沉淀出現，用雙蒸H2O分散少量沉淀并滴加到銅網上，待水分晾干后，使用投射電鏡觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 DNA-纖維素層析制備DNA結合蛋白

先用0.1 mol/L NaCl溶液洗滌雜蛋白，從第8管起出現紫外吸收峰，至第19管出現最大紫外吸收峰值，其后出現2個吸收峰，第48管后，其紫外吸光度低于0.001，持續洗脫到第100管，其紫外吸光度均低于0.001。再更換1 mol/L NaCl溶液洗脫DNA結合蛋白，從第107管起出現紫外吸收峰，至第113管出現第一個峰，此后出現幾個未分開的吸收峰，到第135管后紫外吸光度低于0.001，為確保DNA結合蛋白洗脫干凈，持續使用1 mol/L NaCl溶液洗脫至第170管，其紫外吸光度均低于0.001。將DNA結合蛋白和雜蛋白洗脫峰面積分別積分，其積分比約為1∶9（圖1）。

2.2 SDS-PAGE分析DNA結合蛋白

從圖2可以看出，經過DNA-纖維素層析得到的DNA結合蛋白條帶明顯比總蛋白條帶要少，是因為總蛋白中一些低豐度的蛋白得到了富集，而大部分高豐度的蛋白得以去除，DNA結合蛋白相對分子質量基本上小于974 000，是以小分子量的蛋白為主。

2.3 DNA結合蛋白的質譜鑒定

將DNA-纖維素層析獲得的蛋白質樣品利用LCMS/MS分析，共獲得2 062個肽段的信息，經檢索鑒定得到28個同源蛋白（表1）。這些蛋白包括組蛋白、磷酸激酶、RNA合成相關的蛋白及一些功能未知的蛋白質等。

2.4 染色質體外組裝

將金柑葉片的DNA與DNA結合蛋白在高鹽的條件下混合，通過10倍稀釋法使鹽濃度降低，在稀釋過程中發現溶液中逐漸出現絮狀沉淀，隨著絮狀沉淀增多，絮狀沉淀慢慢地靠攏聚集形成馬尾狀（圖3）。

挑取少量馬尾狀沉淀，用雙蒸H2O分散，再通過透射電鏡下觀察，發現沉淀物有如植物根系般，盤根錯節，進一步發現在某些主鏈上有許多的分支，而這些主鏈和分支均是由一些球狀體連接而成（見圖4）。

在染色質體外組裝體系中，成分有DNA、蛋白質以及無機鹽（以NaCl為主）。顯然，單獨的純的DNA或蛋白質，亦或是無機鹽都不會在稀釋的過程中產生沉淀，因此，沉淀的出現極可能是DNA和DNA結合蛋白相互作用形成了DNA-DNA結合蛋白復合物。據趙忠亮等[10]提出的4種體外染色質組裝體系方法中，有一種為利用組蛋白轉運媒介物（如：鹽濃度透析、組蛋白結合蛋白等），形成組蛋白體系，此體系可產生規范的核小體，但是形成的核小體分布卻不規則。因此，圖4中如念珠狀的小黑圓點極可能是核小體，進而推測DNA和DNA結合蛋白互作發生了染色質體外組裝現象。

3 結論與討論

所有在真核細胞中發生的如轉錄、復制、重組以及修復等生命過程，都需要染色質的參與。趙忠亮等[10]研究表明，高度包裝的染色質是無法進行轉錄的，而在轉錄延伸的過程中，染色質必須經過解體才能完成轉錄，這就存在一個問題，即：蛋白質是如何涉足解體后的染色質的重新組裝？而最早研究體外染色質的重新組裝是在生理條件下依賴爪蟾卵母細胞的提取物，這些提取物富含酸性蛋白、核質蛋白以及組蛋白等，它們能有序地結合到DNA上，裝配成有一定空間距離的多核小體，進而組裝成染色質[15]。Monique Barat[12]的研究表明，利用DNA纖維素層析的DNA結合蛋白能與爪蟾卵母細胞的線粒體DNA在低鹽條件下按約1∶1的比例結合形成如念珠狀的核小體染色質。

本研究中利用純化的基因組DNA和DNA結合蛋白進行了染色質的體外組裝，結果表明二者可以發生相互作用，產生沉淀，通過電鏡觀察到類似念珠狀的核小體。這一方面說明能有效采用DNA-纖維素層析方法獲取得到DNA結合蛋白；另一方面也說明DNA與DNA結合蛋白也可以發生相互作用，組裝成類似分布不規則的核小體，仍需進一步確認染色質是否重建。現代技術能在染色質包裝的核小體水平上對轉錄的啟動和延伸進行相關的生化與分子方面的研究，若能構建無細胞的染色質組裝體系，這對于進一步研究蛋白質調控基因的表達具有重要意義。

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Separation of Kumquat DNA-Binding Proteins and Chromatin Assembly in Vvitro

LI Meng-yun1，LI Guang-feng1,2，YANG Hua1，LI Zi-yun1，WU Xiao-ping1，RAO Li-qun1

（1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Hunan Food and Drug Vocational College, Changsha 410208, PRC）

In order to study the interaction between DNA and DNA-binding proteins, an acellular system of chromatin assembly in vitro was established. The total DNA of kumquat leaves were extracted, the DNA-cellulose chromatography ligand was obtained with the microcrystalline cellulose, and then DNA-binding proteins were isolated through the DNA- cellulose chromatography. Finally, the purifed DNA and DNA-binding proteins were mixed at a certain proportion under low salt conditions and then observed with electron microscopy. The results showed that the mixture produced flocculent precipitates, and beaded little black dots were found out by the electron microscopy. It indicated that DNA and DNA-binding proteins had interactions, which might lead to the formation of nucleosomes and cause chromatin assembly in vitro.

kumquat; DNA-binding protein; cellulose chromatography; assembly in vitro

S666

A

1006-060X（2015）08-0004-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.002

2015-06-25

國家自然科學基金 (No. 31200963)；湖南省教育廳優秀青年項目（No.13B046）；湖南省科技計劃項目（No. 2009NK3096）；湖南省教育廳科學研究項目（No.13C576）

李夢蕓（1988-），女，湖南雙峰縣人，碩士研究生，研究方向：植物抗逆生物化學；并列第一作者：李光鋒（1964-），男，湖南寧遠縣人，博士研究生，研究方向：植物抗逆生物化學。

楊 華，饒力群