胰腺癌Kras基因突變與Glut1高表達協同促進腫瘤發生

吳丹，王彩蓮，李春妍，鄭士亞

(1.東南大學醫學院附屬江陰醫院 腫瘤科，江蘇 江陰 214400； 2.東南大學附屬中大醫院 腫瘤科，江蘇 南京 210011； 3.南京醫科大學，江蘇 南京 210029)

·論 著·

胰腺癌Kras基因突變與Glut1高表達協同促進腫瘤發生

吳丹1，王彩蓮2，李春妍3，鄭士亞2

(1.東南大學醫學院附屬江陰醫院 腫瘤科，江蘇 江陰 214400； 2.東南大學附屬中大醫院 腫瘤科，江蘇 南京 210011； 3.南京醫科大學，江蘇 南京 210029)

目的：探討胰腺癌組織中Kras基因點突變的表達以及葡萄糖轉運蛋白-1(Glut1)表達在促進癌細胞惡性增生中的意義及作用，研究兩者之間的相關性。方法：收集46例胰腺癌患者組織蠟塊，應用免疫組織化學染色技術檢測Glut1在胰腺癌中的表達，熒光定量PCR測序法檢測胰腺癌標本中Kras基因點突變率。結果：46例胰腺癌中Glut1的陽性表達為40例(86.9%)，正常癌旁組織中Glut1不表達，兩者差異有統計學意義(P<0.01)。Glut1的表達與年齡、腫瘤大小、腫瘤部位相關(P<0.05)，與性別、淋巴結轉移、神經侵犯、病理分級、臨床分期、病理類型無關。在46例胰腺癌患者中有26例存在Kras基因點突變(56.5%)，其中24例12密碼子突變(G34D 3例，G35D 21例)；2例13密碼子突變(G38D 1例，C39D 1例)。Kras基因點突變與腫瘤大小、神經侵犯相關(P<0.05)，與年齡、性別、淋巴結轉移、腫瘤部位、臨床分期、病理類型、病理分級無關。胰腺癌中Glut1蛋白呈高表達時，Kras基因存在明顯突變，有明顯相關性(r=0.99，P<0.05)。結論：Glut1高表達與Kras基因異常表達可能協同促進了胰腺癌的惡性病變。

胰腺癌； Kras基因； 葡萄糖轉運蛋白-1； 糖酵解

胰腺癌是惡性程度極高的癌癥之一，早期診斷困難，療效差，總體死亡率高達98%[1]，中位生存期為診斷后4～6個月，5年生存率僅為5%[2]。掌握胰腺癌發生、發展的分子生物學機制并針對特定通路進行治療的手段，為胰腺癌的早期診斷以及治療提供有益的線索尤為重要。

我們通過運用免疫組織化學染色及PCR方法分別檢測46例胰腺癌組織標本中葡萄糖轉運蛋白-1(Glut1)的表達和Kras(Kirsten rat sarcoma viraloncogene homolog)基因突變，分析兩者之間的相關性，在分子水平上初步探討胰腺癌發生發展的機制，為胰腺癌的早期診斷及治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

來自江陰市人民醫院2005年1月至2014年12月間經外科手術切除的胰腺癌組織石蠟標本，共46例。所有病例資料完整，均經病理組織學確診，按照胰腺癌TNM分期標準進行分期[3]。其中男25例，女21例；年齡37～84歲，中位年齡66歲；高分化腺癌(Ⅰ級)10例，中分化腺癌(Ⅱ級)21例，低分化腺癌(Ⅲ級)15例；發生淋巴結轉移15例。病理分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期21例。同時切取癌旁的胰腺組織標本作為正常胰腺組織對照。

1.2 主要試劑

兔抗人Glut1多克隆抗體(南京巴傲得生物科技有限公司)，免疫組化EliVision plus試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)，人類Kras基因突變檢測試劑盒(蘇州科貝生物技術有限公司)。

1.3 胰腺癌組織及正常組織中Glut1免疫組化檢測

(1) 采用免疫組化S-P法，參照EliVision plus試劑盒說明書進行，具體如下：取胰腺癌組織，連續石蠟切片，60 ℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟，然后水化，0.5%過碘酸處理后，予PBS沖洗；接著浸入檸檬酸緩沖液修復液加熱，再用PBS沖洗；滴加3%雙氧水，再次PBS沖洗；最后滴加正常山羊血清封閉液；滴加Glut1多克隆抗體一抗50 μl(稀釋度1∶250)，放入4℃冰箱過夜；第2天復溫，PBS沖洗，并依次滴加生物素標化二抗，辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素溶液，PBS沖洗；最后DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，中性樹脂封片，鏡下查看切片。每組切片均以PBS代替一抗作為陰性對照，其他步驟同前。

(2) 免疫組化結果判斷：Glut1陽性表達定位于細胞膜和(或)細胞質。按腫瘤細胞陽性比率評分：0分，沒有細胞著色；1分，腫瘤細胞陽性率≤5%；2分，腫瘤細胞陽性率6%～14%；3分，腫瘤細胞陽性率15%～30%；4分，腫瘤細胞陽性率>30%。按腫瘤細胞著色強弱評分：0分，沒有細胞著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。腫瘤細胞陽性率評分+腫瘤細胞著色強弱評分作為最終評分。根據最終評分，將Glut1染色分為4個等級：0-1分為陰性(0)，2-3分為弱陽性(1+)，4-6分為陽性(2+)，>6分為強陽性(3+)。片內正常胰腺組織及間質細胞無著色，作為陰性對照。

1.4 PCR檢測胰腺癌組織中Kras突變基因的表達

(1) 基因組DNA抽提：采用Qiagen公司的DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)提取組織DNA，常規切片厚4 μm 5～10張，經脫蠟、蛋白酶K消化及離心，將DNA洗脫。將DNA稀釋，稀釋至質量濃度為100 ng·μl-1，體積為50 μl。1張用于HE染色觀察形態，其余用于下一步提取DNA；顯微鏡下觀察HE切片，選取富于腫瘤細胞的區域，對應HE切片將腫瘤組織刮入裂解液，保證腫瘤成分80%以上。

(2) PCR法擴增Kras基因第2號外顯子：根據Kras基因組DNA序列設計PCR引物，Kras基因第2號外顯子上游引物為KRAS F1(GCCTGCTGAAAATGACTGAA)和KRAS F2(AAGGCCTGCTGAAAATGACTG)，下游引物為KRAS R1 (GTATCGTCAAGGCACTCTTGC)和KRAS R2 (AGAATGGTCCTGCACCAGTAA)。PCR反應體系20 μl，反應條件如下： 95 ℃預變性15 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共45個循環;72 ℃延伸2 min，至40 ℃結束。以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對照，已知陽性病例作為陽性對照。取PCR擴增產物5 μl，2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色。

(3) DNA測序：將DNA PCR產物(20 μl)磁珠純化，配制測序反應體系，總反應體積5 μl，蓋緊PCR 管，用手指彈管混勻，稍離心后，將PCR 管置于PCR 儀上進行擴增。反應產物醋酸鈉純化后，上ABl3730 DNA Analyzer進行PAGE電泳。采用Sequence Analysis 軟件進行序列分析。

1.5 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理，Glut1表達、Kras突變與各臨床指標的關系之間比較采用卡方檢驗，Glut1表達與Kras突變的相關性用Spearman法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Glut1在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達結果

46例胰腺癌組織中，Glut1棕黃色或棕褐色陽性染色顆粒位于細胞質和(或)細胞膜，主要定位于細胞膜，陽性表達率為86.9%(40/46)，正常胰腺組織中無陽性表達(表1、圖1)，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 Glut1 在胰腺組織中的表達

2.2 Kras在胰腺癌中的突變情況

46例胰腺癌患者中有26例患者存在Kras基因突變(56.5%)，其中24例12密碼子突變(G34D 3例，G35D 21例),2例13密碼子突變(G38D 1例，C39D 1例)。

2.3 胰腺癌中Glut1蛋白表達及Kras基因突變與胰腺癌臨床病理特征的關系

胰腺癌組織中Glut1表達與年齡、腫瘤大小、腫瘤部位具有顯著相關性，差異具有統計學意義(P<0.05)。Kras的突變與腫瘤大小和神經侵犯相關，差異具有統計學意義 (P<0.05)。見表2。

2.4 胰腺癌中Glut1蛋白表達與Kras基因突變的相關性

在Glut1陽性表達的標本中，隨著Glut1染色評分的遞增，KRAS基因的突變率明顯增加，差異具有統計學意義(r=0.99，P<0.05)。見表3。

3 討 論

Kras基因是Ras原癌基因家族的一員，其表達與細胞生長及分化密切相關[4]。以往研究證實，超過90%的胰腺癌都存在Kras基因的點突變[5]。在胰腺癌中，單氨基酸置換G12、G13或Q61導致K-ras GTP水解活性失活，而且降低了對GAP的敏感性，從而導致磷酸化的K-ras持續聚積，與下游效應分子結合，導致了細胞的惡性轉化[6]。Glut1是分布最廣泛的葡萄糖轉運蛋白，是一種膜性易化葡萄糖轉運蛋白，它的功能是運輸葡萄糖進入上皮細胞及促進細胞的代謝[7]，它的表達強弱與腫瘤惡性程度有關[8]。

A.正常胰腺組織中Glut1表達為陰性，標記為(-)(×100)； B.胰腺癌組織中Glut1陰性表達，標記為(-)(×200)； C.胰腺癌組織中的Glut1的弱陽性表達，標記為(1+)，(×200)； D.胰腺癌組織中的Glut1的中度陽性表達，標記為(2+)(×200)； E.胰腺癌組織中Glut1強陽性表達，標記為(3+)(×200)

圖1 免疫組化檢測Glut1在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達

表2 Glut1表達及Kras突變與患者臨床病理特征的關系

表3 Glut1表達與Kras突變之間的相關性

Spearman’s rank test法：r=0.99，P=0.033

在低糖環境下Kras野生型細胞很難存活，而存活下來的Kras突變型細胞中Glut1高表達，且其中4%發生親代未出現過的Kras突變[9]。進一步研究表明，Kras基因突變與Glut1表達在肺癌組織中也存在一定的的相關性[10]。兩者關系在胰腺癌組織中是否相關，目前還沒有相應的臨床研究。鑒于此，我們以胰腺癌組織為標本，檢測了46例癌組織切片中Glut1的表達及Kras的突變，結果顯示胰腺癌中Kras基因突變率為56.5%，主要是12位點突變。而Glut1蛋白陽性表達率為86.9%，對應癌旁組織基本無表達，且其與Kras突變率呈正相關，提示KRAS基因突變可上調Glut1的表達。

在胰腺癌治療中以Kras突變的靶向治療方案并沒有取得令人驚喜的研究進展[11-12]。因此，我們便進一步探討針對細胞Kras基因的下游靶點的療法研究。PET/CT是胰腺癌的可靠而有效的診斷方法[13]，而利用氟代脫氧葡萄糖(FDG)可以動態監測腫瘤細胞葡萄糖吸收。目前，抗腫瘤細胞能量代謝正成為抗腫瘤治療的研究熱點。與正常細胞不同，腫瘤細胞即使在供氧充足的情況下，葡萄糖依舊向乳酸轉換，這種代謝稱為有氧酵解或“Warburg效應”。研究發現，缺氧可誘導卵巢癌和肺癌細胞FDG攝入量增加，并可通過低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)HIF-Ia上調Glut1的表達，促進腫瘤細胞糖代謝。

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癌基因Ras的突變或者過表達常見于惡性腫瘤，通過介導HIF表達，來促進糖酵解。在應用誘導Kras G12位點突變建立的胰腺癌小鼠模型中，Kras G12位點突變在控制腫瘤代謝中作用很大，主要通過刺激葡萄糖攝取，驅動糖酵解，促進腫瘤發生發展[14]。已有研究結果[15]證實，針對糖酵解過程的腫瘤治療手段是可行的。Kras突變與Glut1存在一定的相關性[16-17]。因此，我們猜想胰腺癌細胞Glut1的高表達可能與腫瘤在低氧環境下Kras基因的突變介導HIF的高表達有關，但是仍需要大量后續研究去證實。靶向Glut1及糖酵解治療胰腺癌也不失可作為Kras分子靶向治療的新手段，且具有良好的應用前景。

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Synergy of tumorigenesis between high-Glut1 expression and Kras mutation in pancreatic cancer

WU Dan1，WANG Cai-lian2,LI Chun-yan3，ZHENG Shi-ya2

(1.DepartmentofOncology，theAffiliatedJiangyinHospitalofSoutheastUniversityMedicalCollege，Jiangyin214400，China; 2.DepartmentofOncology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 3.NanjinMedicalUniversity，Nanjing210029，China)

Objective: To analyze the relationship between overexpression of Glut1 and Kras mutations in pancreatic cancer.Methods:In 46 cases of pancreatic carcinoma and 46 cases of tumor adjacent normal pancreatic tissues，immunohistochemistry was performed for Glut1 expression status. Kras mutation status was also evaluated using PCR-based assays.Results:Glut1 expression was increased in 40(86.9%) pancreatic cancer cases. At the same time ，it was not expressed in adjacent controls (P<0.001).The Glut1 overexpression was significantly associated with age(<56，62.5%vs>56，92.1%，P<0.05)，tumor size(<6 cm，92.1%vs>6 cm，62.5%，P<0.05)，tumor location(head，100%vsnon-head，71.4%，P<0.01)，Kras mutation was found in 26 (56.5%) pancreatic cancer cases. The Kras mutation was associated with tumor size(<6 cm, 63.2%vs>6 cm, 25%，P<0.05)，nerve invasion (absent，51.3%vspresent，88.9%，P<0.05). The Glut1 overexpression status was significantly correlated with Kras mutation status (r=0.99，P<0.05).Conclusion:Our results strongly suggest that overexpression of Glut1 is significantly correlated with Kras mutations in pancreatic cancer to increase the tumor genesis．

pancreatic cancer; glucose transporter isoform 1; Kras; glycolysis

2015-09-22

2015-10-14

吳丹(1978-)，女，江蘇江陰人，主治醫師。E-mail:wudan96121@163.com

吳丹，王彩蓮，李春妍，等.胰腺癌Kras基因突變與Glut1高表達協同促進腫瘤發生[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(6)：982-986.

R735.9

A

1671-6264(2015)06-0982-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．028