大蒜辣素對高糖環境下肝癌細胞HepG2/mdr耐藥性影響及其機制研究

燕丹，童本定，丁年羊，吳楠，王蕾，唐文婧，魏青

(江蘇省腫瘤醫院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

大蒜辣素對高糖環境下肝癌細胞HepG2/mdr耐藥性影響及其機制研究

燕丹，童本定，丁年羊，吳楠，王蕾，唐文婧，魏青

(江蘇省腫瘤醫院，江蘇 南京 210009)

目的:探討大蒜辣素(allicin)對高糖環境下肝癌細胞HepG2/mdr耐藥性影響及其機制。方法：采用細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit-8)檢測細胞株HepG2/mdr活性； RT-PCR檢測allicin作用后HepG2/mdr中晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)、核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、多藥耐藥基因-1(multidrug resistance-1，MDR1) 的轉錄水平；蛋白質免疫印跡法(Western blotting)檢測allicin作用后HepG2/mdr細胞中相關基因的蛋白表達。結果:HepG2/mdr細胞呈對數生長，可以作為后續實驗的靶細胞。RT-PCR和Western blotting檢測表明，隨著allicin質量濃度的增加，RAGE、NF-κB、MDR1 轉錄水平降低，蛋白表達量減少，呈現劑量依賴性。結論:allicin能通過影響腫瘤細胞NF-κB的核轉錄因子活性調控下游 MDR1 基因的表達，從而逆轉高糖狀態下HepG2/mdr細胞的耐藥性。

大蒜辣素; 肝癌細胞HepG2/mdr; 多藥耐藥

高糖環境下肝癌細胞耐藥現象產生與上調多藥耐藥基因MDR1(multidrug resistance-1，MDR1)的表達有關[1]。該基因的蛋白表達受到高度調控，特別是在轉錄水平[2]。大蒜辣素(allicin)為大蒜有效成分，含還原態硫，具有較強的抗氧化能力，歐洲藥典等將其當作大蒜有效成分標準物質[3]。 長期食用大蒜可以降低多種腫瘤(特別是胃腸道腫瘤)的發生發展[4]。目前國內外的流行病學調查和試驗研究證明，allicin具有良好的預防腫瘤發生和抑制腫瘤生長作用[5]。allicin可以通過多種機制來對腫瘤進行抑制，如影響致癌物代謝、誘導腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤細胞周期、抗氧化以及調節免疫[6-7]。allicin如何逆轉高糖環境下腫瘤細胞多藥耐藥性，至今未見報道，值得深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)購自BioVision公司，純度大于98%，用DMSO配置成母液，4℃冰箱保存，臨用前稀釋成所需質量濃度。人肝癌細胞(human hepatocarcinoma cells)HepG2，購自中國科學院上海細胞庫，HepG2/mdr細胞[8]為本課題組前期實驗誘導的阿霉素耐藥細胞株。胰蛋白酶、低糖DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司。青霉素、鏈霉素為杭州四季青公司產品。TRLzol購自美國Gibco公司，cDNA合成試劑盒、DEPC水為美國Fermentas公司產品。Western blotting試劑盒購自英國ABCam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及觀察 HepG2細胞培養于含10%FBS的低糖DMEM培養液中，37℃、體積分數5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。倒置顯微鏡下觀察，細胞生長良好無污染，透明度大、折光性強、可見到很多分裂期細胞，呈單層貼壁生長。

1.2.2實驗分組 實驗分為陽性對照組(培養液中含有終質量濃度為400 μg·ml-1的AGEs)、空白對照組(單純培養液培養)和AGEs-Allicin組(3組藥物干預實驗的培養液中AGEs質量濃度固定為400 μg·ml-1，allicin終質量濃度分別設定為6、12和24 μg·ml-1)。

1.2.3CCK-8法繪制細胞生長曲線 取對數生長期的細胞，用含10%EDTA胰蛋白酶消化，分別制備HepG2和HepG2/mdr單細胞懸液，以細胞數每孔2 500個接種至96孔培養板，每孔100 μl。按CCK-8檢測試劑盒說明書分別于細胞貼壁后(0 h)、24、48、72、96h時間點，每孔加入CCK-8試劑10 μl。分光光度計分別測450 nm時的吸光度值(A)，以培養時間(t)為橫坐標，A值為縱坐標，繪制細胞的生長曲線，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.4RT-PCR檢測目的基因轉錄水平 提取細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)為引物(引物設計見表1)，利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，從而獲得檢測基因表達。PCR儀設定反應程序為：95 ℃，5 min，94 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s；擴增循環均為35個循環，72 ℃延伸加時5 min，冷卻至4 ℃，-20 ℃保存待用。PCR產物于瓊脂糖凝膠電泳中觀察，紫外分光儀成像分析。

表1 引物設計

1.2.5Western blotting檢測蛋白表達變化 提取細胞總蛋白及測定蛋白濃度參照試劑盒說明。按每5×106細胞加入100 μl RIPA裂解液，裂解10 min，制備總蛋白，BCA法測定各組細胞蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離各目的基因相關蛋白。將分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，一抗(鼠抗人：1∶200)4℃孵育12 h，PBS洗膜5 min×4次;二抗(兔抗山羊∶1∶1 000)室溫孵育2 h，PBS洗膜5 min×4次。實驗所得Western blotting條帶，由Photoshop軟件處理，在Bandscan分析軟件中測得各自的總灰度值，進行定量比較分析，并且均采用自身β-actin灰度值校正。

1.3 統計學處理

每項實驗至少重復3次，應用SPSS 17.0進行統計學分析，計量數據用均數±標準差表示，組間比較用t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HepG2/mdr細胞形態及生長的變化

細胞貼壁72 h后，HepG2、HepG2/mdr分別進入對數生長期，倒置顯微鏡下觀察，細胞生長良好，透明度大、折光性強，可見很多分裂期細胞，呈單層貼壁生長(圖1)。 從生長曲線分析可見，HepG2/mdr生長速度雖然較HepG2細胞生長緩慢，但差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。鑒于本研究主要探究allicin對高糖環境下肝癌細胞HepG2耐藥性的影響，故本實驗選用HepG2/mdr細胞作為后續實驗的靶細胞。

A.HepG2組； B.HepG2/mdr組

圖1 HepG2和HepG2/mdr細胞72 h形態圖(×200)

圖2 HepG2與HepG2/mdr生長曲線

2.2 高糖環境下allicin對HepG2細胞RAGE、NF-κB、MDR1 mRNA表達的影響

提取的總RNA經瓊脂糖凝膠電泳顯示出的18S和28S的RNA區帶清晰明亮，且兩者條帶亮度比例約為1∶2，說明提取的RNA無明顯降解，如圖3。以目的基因與β-actin的灰度比值代表mRNA相對表達水平，檢測各組灰度值，結果顯示：allicin不同質量濃度組間RAGE、NF-κB、MDR1 mRNA表達水平不同，隨著allicin質量濃度的增加，RAGE、NF-κB、MDR1 mRNA表達減少(圖4)，呈現劑量依賴性，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖3 HepG2細胞總RNA完整性鑒定

A.陽性對照組；B.空白對照組；C.AGEs-allicin組(6 μg·ml-1); D.AGEs-allicin組(12 μg·ml-1)； E.AGEs-allicin組(24 μg·ml-1)

圖4 高糖環境下allicin對HepG2細胞RAGE、NF-κB、MDR1 mRNA表達的影響

與陽性對照組比較，aP<0.05； 與陰性對照組比較，bP<0.05

2.3 高糖環境下allicin對HepG2細胞RAGE、NF-κB、MDR1 蛋白表達的影響

在高糖環境下，不同濃度allicin作用HepG2/mdr細胞后，RAGE、NF-κB、MDR1的蛋白表達水平的變化見圖5。經allicin處理HepG2/mdr細胞24 h后，RAGE、NF-κB、MDR1蛋白表達下調，同對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，其中陽性對照組3種蛋白表達量最高(表3)。

A.陽性對照組； B.陰性對照組； C.AGEs-allicin組(6 μg·ml-1)；D.AGEs-allicin組(12 μg·ml-1);E.AGEs-allicin組(24 μg·ml-1)

圖5 高糖環境下allicin對HepG2細胞RAGE、NF-κB、MDR1 蛋白表達的影響

3 討 論

我國是世界上肝癌發病最集中的國家，每年新發病例約占全球的50%以上[9]；而在糖尿患者群中，肝細胞癌的發病率明顯高于一般人群。高血糖狀態促進糖基化過程加快，導致體內AGEs蓄積，AGEs與錨定在細胞膜表面的蛋白受體RAGE 結合[10]，激活以無活性的形式存在于胞漿中NF-κB發生磷酸化并降解，進入細胞核內，與DNA鏈上特異部位結合，發揮轉錄激活活性，啟動下游與腫瘤生物學行為相關的多條信號轉導通路，導致某些基因表達水平的改變[11-12]。

近年來，隨著化療方案的不斷改進，治療腫瘤的效果已明顯改善。然而多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)的產生則成為目前肝癌化療不能有效緩解或者緩解后復發的主要原因。由MDR1編碼的糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)所發生的外排泵作用是細胞內藥物濃度下降從而導致MDR的主要原因。研究表明，轉染變異的NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)可抑制多種腫瘤細胞NF-κB的活性，減少MDR1的表達，增強細胞內化療藥物的濃度，細胞凋亡率升高，從而逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥[13]。由此可見，MDR1基因及其產物的過度表達扮演了重要角色。然而，MDR1

與陽性對照組比較，aP<0.05； 與陰性對照組比較，bP<0.05

的化學逆轉劑因毒性較大而難于廣泛用于臨床，尋找開發高效低毒能夠逆轉腫瘤多藥耐藥性的藥物是目前研究的重要課題。

流行病學調查顯示，經常攝入大蒜的人其發生腫瘤的幾率比未經常攝入大蒜的人發生腫瘤的幾率低，且在已經發生腫瘤的患者中經常攝入大蒜的人其腫瘤發展的速度比未經常攝入大蒜的人腫瘤發展的速度慢[14]。大蒜作為一種對人類疾病有確切療效的天然植物藥物，現代藥理學證明其中的活性成分二烯丙基硫代亞磺酸酯，俗稱大蒜辣素(allicin)，是其重要藥用功能的物質基礎[15]。allicin能否逆轉高糖環境下腫瘤細胞多藥耐藥性，至今未見文獻報道，值得深入研究。

本實驗通過課題組前期實驗誘導的阿霉素耐藥細胞株HepG2/mdr細胞[8]探究allicin對高糖環境下肝癌細胞HepG2耐藥性的影響。 CCK-8結果表明，HepG2/mdr是研究高糖環境下腫瘤MDR很好的工具。 RT-PCR及Western blotting結果證實了allicin通過影響腫瘤細胞核轉錄因子NF-κB活性，抑制HepG2/mdr細胞MDR1 mRNA表達和降低MDR1蛋白表達水平，說明allicin能逆轉HepG2/mdr細胞的多藥耐藥性。

總之，allicin除可以通過影響致癌物代謝、誘導腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤細胞周期、抗氧化以及調節免疫等機制抑制腫瘤外，還可能具有逆轉高糖環境下腫瘤細胞多藥耐藥性作用。

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Mechanism of allicin on drug resistance of HepG2/mdr hepatocellular carcinoma cells in high glucose

YAN Dan，TONG Ben-ding，DING Nian-yang，WU Nan，WANG Lei，TANG Wen-jing，WEI Qin

(JiangsuCancerHospital，Nanjing210009，China)

Objective: To investigated mechanism of allicin on drug resistance of HepG2/mdr hepatocellular carcinoma cells in high glucose. Methods: Cell counting kit-8(CCK-8) assay was used to assess the HepG2/mdr cells activity，The expression change of mRNA and protein among RAGE、NF-κB and MDR1 were examined by RT-PCR and Western-blot. Results: The results of CCK-8 assay showed that HepG2/mdr cells present logarithmic growth could be used as target cells in the following study，RT-PCR and Western blotting experimental results showed that allicin could reduce transcription level and decrease protein expression of RAGE、NF-κB、MDR1. the phenomena were more obvious when allicin concentration increasing. Conclusion: Allicin could reverse drug resistance of tumor cells to therapy. It showed that MDR was dramatically down-regulated in a Allicin-dependent manner in response to NF-κB changes．

allicin; hepatocellular carcinoma HepG2/mdr cells; multidrug resistance

2015-07-02

2015-08-28

燕丹(1980-)，女，安徽蕪湖人，主管藥師，藥學博士。E-mail:sharon06243731@sina.com

魏青 E-mail:jsschwq@sina.com

燕丹，童本定，丁年羊，等.大蒜辣素對高糖環境下肝癌細胞HepG2/mdr耐藥性影響及其機制研究[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(6)：987-991.

R735.7

A

1671-6264(2015)06-0987-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．029