HPLC-ELSD測定不同主產(chǎn)地黃芪飲片中黃芪甲苷的含量*

黃 銳，蒲清榮，趙 劍，明俊男，羅 群，李 靜

(四川醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

HPLC-ELSD測定不同主產(chǎn)地黃芪飲片中黃芪甲苷的含量*

黃 銳，蒲清榮△，趙 劍，明俊男，羅 群，李 靜

(四川醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

目的 測定不同批次，不同產(chǎn)地的黃芪飲片中黃芪甲苷的含量。方法 收集8個(gè)批次，4個(gè)主產(chǎn)地(甘肅、山西、內(nèi)蒙古、四川)的黃芪飲片；采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷含量。結(jié)果 黃芪甲苷在0.03696～0.924 mg·mL-1時(shí)，進(jìn)樣量的對數(shù)與峰面積的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為98.63%，RSD為1.76%。結(jié)論 所建立的方法可有效評價(jià)黃芪飲片的質(zhì)量；測定結(jié)果表明，不同主產(chǎn)地黃芪飲片黃芪甲苷含量差異較大，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意區(qū)分。

黃芪飲片；黃芪甲苷；HPLC-ELSD

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao.或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。春、秋二季采挖，除去雜質(zhì)，大小分開，洗凈，潤透，切厚片，干燥即得飲片[1]。黃芪是傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品，有補(bǔ)氣升陽，固表止汗，利水消腫，托瘡生肌等功效，用于氣虛乏力，中氣下陷，表虛自汗，久潰不斂等癥。黃芪的主要成分為三萜皂苷和黃酮類[2]。為了探索黃芪飲片的質(zhì)量，特采用HPLC-ELSD法測定黃芪中含量較大的黃芪甲苷，以建立黃芪飲片質(zhì)量控制方法的建立提供科學(xué)、可靠的依據(jù)。

1 材料

日本島津高效液相色譜儀(LC-20AT泵、ELSD檢測器、CTO-10AS進(jìn)樣器、LcSolution色譜工作站)；AUW120D十萬分之一電子天平(日本島津)；JP全數(shù)字超聲波發(fā)生器(武漢嘉鵬電子有限公司)；黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院，批號為110781-200613)；甲醇、乙腈為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純；所購藥材經(jīng)瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院唐燦教授鑒定為蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao.]。具體見表1。

表1 黃芪樣品信息

2 黃芪甲苷含量測定[3-4]

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Inertsil ODS-SP C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(32∶68)，柱溫40 ℃，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，蒸發(fā)光散射檢測參數(shù)：漂移管溫度45 ℃，press.350kpa。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品9.24 mg，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 黃芪飲片適量，60 ℃干燥1 h，粉碎成細(xì)粉，取約4 g，精密稱定，置索式提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2 次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過D101 型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5 cm，長12 cm)，以水50 mL洗脫，棄取水液，再用40 % 乙醇30 mL洗脫，棄取洗脫液，繼用70 %乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液0.4，0.8，1.0，2.0，4.0 mL分別于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，取10 μL注入液相色譜儀，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)。以峰面積的對數(shù)Y為縱坐標(biāo)，對照品的進(jìn)樣濃度的對數(shù)X(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1.5167X+14.752，r2=0.999 5，結(jié)果表明黃芪甲苷在0.03696～0.924 mg·mL-1時(shí)，進(jìn)樣量的對數(shù)與峰面積的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液10 μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得黃芪甲苷峰面積RSD為0.65 %。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取表1中HQ1號樣品按“2.1.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣10 μL注入液相色譜儀，測定黃芪甲苷峰面積，結(jié)果RSD 為1.56 %，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取表1中HQ1號樣品6份，按照“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)行測定，計(jì)算黃芪甲苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明黃芪甲苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4036 mg·g-1，RSD 為2.16 %。

2.8 回收率試驗(yàn) 取表1中HQ1號樣品6份，按照“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，取供試品溶液1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加入“2.1.2”項(xiàng)下黃芪甲苷對照品溶液4 mL，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果黃芪甲苷98.63 %(RSD 1.76 %)，說明該方法確實(shí)可行。

2.9 樣品測定 取8批黃芪飲片，每批2份，按照“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液。分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10 μL，供試品溶液10 μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。對照品，樣品-HQ1及樣品-HQ7色譜圖見圖1。結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地黃芪中黃芪甲苷的含量

t/min

A.對照品；B.樣品-HQ1；C.樣品-HQ7；1.黃芪甲苷

圖1 黃芪甲苷高效液相色譜圖

3 討論

黃芪用藥歷史悠久，為常用中藥之一，植物黃芪產(chǎn)于甘肅、山西、內(nèi)蒙古、四川等地，為國家三級保護(hù)植物。主要是制成飲片，調(diào)劑于中藥方劑中，因此研究黃芪飲片的質(zhì)量問題具有重要的意義。研究表明：黃芪中含有多種活性成分，包括黃芪皂苷、黃芪黃酮類成分等。黃芪皂苷中活性研究較系統(tǒng)的為黃芪甲苷，其在黃芪中含量最高，對缺血造成的心、腦損傷具有保護(hù)性作用，同時(shí)具有抗病毒、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等活性[5]。因而綜合考慮，選取黃芪中所含黃芪甲苷，作為質(zhì)量評價(jià)研究的指標(biāo)。

2010年版中國藥典規(guī)定了黃芪飲片含量測定的有效成分是黃芪甲苷不少于0.040 %，換算成質(zhì)量分?jǐn)?shù)即不少于0.40 mg·g-1。從表2結(jié)果可以得出6批次黃芪飲片中黃芪甲苷含量均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)；HQ7、HQ8即來源于四川理塘縣所產(chǎn)黃芪飲片無黃芪甲苷峰面積，在8.406 min時(shí)比其它樣品多一個(gè)峰，說明產(chǎn)自四川的黃芪含有其他成分，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意。

[1]衛(wèi)生部.中國藥典[S].一部.北京：化工出版社，2010.

[2]陳國輝，黃文鳳.黃芪的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2008，17(17)：1482-1485.

[3]徐忠坤，徐海娟，宋娟，等.HPLC法測定芪葛顆粒中黃芪甲苷[J].中草藥，2011，42(1)：94-95.

[4]裴彩云，王宗權(quán)，賈繼明，等.HPLC-ELSD內(nèi)標(biāo)法測定8個(gè)產(chǎn)地黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷的含量[J].中國中藥雜志，2011，36(14)：1982-1984.

[5]張薔，高文遠(yuǎn)，滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2012，37(21)：3203-3207.

四川省科技廳項(xiàng)目(NO：2013SZ0143)

黃銳(1986-)，男，中藥師，碩士，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┭芯浚珽-mail：365369747@qq.com

△通信作者：蒲清榮，Tel：0830-3162253，E-mail：365369747@qq.com

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1007-2349(2015)10-0071-03

2015-07-13)