酒精攝入損傷成年雄性小鼠生殖系統的一氧化氮機制研究

龔建軍，孫俊峰，張忠明，朱建明

酒精攝入損傷成年雄性小鼠生殖系統的一氧化氮機制研究

龔建軍，孫俊峰，張忠明，朱建明

目的 探討酒精攝入損傷成年雄性小鼠生殖系統的一氧化氮機制。方法 選用10周齡的C57BL/6J小鼠，按數字表法隨機分為2組：對照組(10%蔗糖，口服)和酒精攝入組(8 g/kg體質量，口服)。持續15周后，取附睪觀察精子數目及活力；取血分離血清檢測其中睪酮含量；取睪丸組織檢測組織中睪酮含量，檢測睪丸中一氧化氮(NO)水平和過氧化亞硝基陰離子(OONO-)含量，同時檢測睪丸組織中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神經型一氧化氮合酶(nNOS)蛋白表達水平。結果 酒精攝入組與對照組相比，酒精攝入組小鼠精子數目減少[(394±60)×106/ml比(221±55)×106/ml](P<0.05)，精子活力下降[(54±13)%比(23±8)%](P<0.05)；血清中睪酮含量下降(P<0.05)，睪丸中睪酮含量下降(P<0.05)，睪丸中NO水平增加(P<0.05)，OONO-含量增加(P<0.05)，睪丸中iNOS(P<0.05)和nNOS蛋白(P<0.05)表達增加。結論 長期酒精攝入后小鼠睪丸中NO合成增加是導致成年小鼠雄性生殖系統損傷的重要機制之一。

酒精；一氧化氮；成年雄性生殖系統；小鼠

近年來，我國成年男性不育的發病率呈現上升趨勢。其中酒精攝入對于成年男性生殖系統健康的損傷就是其中原因之一。臨床研究發現，長期酗酒者中31%～58%的人群性欲喪失，酒精中毒者中8%出現陽痿。酒精的濫用會導致血清睪酮含量降低、睪丸和附睪重量減少，精囊重量減輕，生殖上皮萎縮[1-2]。

雖然大量的臨床和動物實驗研究已經觀察到酒精對雄性生殖系統方面的損害，但對于其作用機制，現在并不十分明確，這對于尋找有效的預防和治療方法形成很大的障礙。本研究就是從成年雄性小鼠睪丸組織一氧化氮合成的角度來深入了解酒精中毒損傷成年雄性生殖系統的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試劑 10周齡C57BL/6J小鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司)，總一氧化氮含量的檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，睪酮檢測試劑盒(美國R&D生物科技公司)，CELL-VUDRM-600精子計數板(美國Millennium Sciences公司)，內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神經型一氧化氮合酶(nNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體(美國Santa Cruz公司)，RIPA 裂解液等Western blot實驗所需試劑(上海碧云天生物科技有限公司)。

1.2 實驗分組 10周齡C57BL/6J小鼠分為2組：對照組(蔗糖按照5%質量比稀釋，劑量是20 ml/kg體質量)、酒精組(酒精按照20%體積比稀釋，劑量是8 g/kg體質量)，經過口胃管口服，每天早晨進行，每天1次，持續15周。最后1次口服24 h后斷頭處死小鼠，取血、附睪和睪丸組織用于檢測相關指標。

1.3 精子計數和活力的檢測 取出一側附睪，稱質量；置于5 ml的Eppendorf管中，加入泰氏培養液2 ml，剪碎；在30 ℃水浴鍋中振搖15 min(目的是使附睪中的精子自行移行至溶液中)；吸取1滴(大約4 μl)樣品，將樣品置于CELL-VUDRM-600精子計數板的載玻片點樣區的最邊緣，在倒置顯微鏡下查看計數板網格，計數網格中60個小方格中的所有活動和不活動的精子；總的精子計數必須除以12，結果就是精子的濃度：×106/ml；精子活力(%)為活動精子數/總的精子數×100%。

1.4 睪酮的檢測 1 000 g離心血，分離血清備用；取出睪丸，加入3 ml的RIPA 裂解液中勻漿，經4 ℃、14 000 r/min離心15 min，取上清；應用購買的睪酮檢測試劑盒分別檢測血清和上清液中的睪酮含量。睪丸組織中睪酮含量等于睪酮濃度/睪丸質量。

1.5 睪丸中NO含量的檢測 取出睪丸，加入3 ml的RIPA 裂解液中勻漿，經4 ℃、14 000 r/min離心15 min，取上清；用碧云天公司生產的總一氧化氮含量的檢測試劑盒完成檢測。通過檢測出其中所含有的亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量，推算出組織中總的一氧化氮的生成量。按公式(相對值=總的一氧化氮濃度/睪丸質量)計算出可用于相互比較的相對值。

1.6 過氧化亞硝基陰離子(OONO-)的生成 在手術顯微鏡下將大鼠的視網膜取下，置于含有二乙基二硫代氨基甲酯的Krebs-HEPES溶液中洗2次，切成碎片，以1-羥基-3-羧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷為探針，37 ℃條件下孵育30 min，置于冰上停止反應，取50 μl反應溶液置于一次性玻璃毛細管中，使用BenchTop電子順磁共振分光光度計e-scan R(德國)檢測組織樣品中OONO-的生成。

1.7 蛋白表達的檢測 取小鼠睪丸，加入1 ml的RIPA 裂解液中勻漿,經4 ℃、15 000 r/min離心15 min，吸取上清；測濃度后，95 ℃條件下實現蛋白變性。制備SDS-PAGE凝膠，以20 μl蛋白每泳道上樣品，經8% SDS-PAGE后，100 V 1 h電轉移至硝酸纖維膜。用5%脫脂奶粉封閉。依次加入目標蛋白的一抗iNOS、eNOS、nNOS蛋白及辣根過氧化物酶標記的二抗β-actin和二抗，ECL顯色劑顯色，用GIS系統定量掃描灰度值。以同一標本β-actin的產物光密度值作為內參,校正各自目的蛋白的積分光密度值,按公式(相對值= 目標蛋白表達強度/β-actin表達強度)計算出相對值。

1.8 統計學處理 所有計量數據均以均數±標準差(x±s)表示，采用SPSS 12.0統計軟件分析，非配對t檢驗分析進行組間差異顯著性檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 精子數目與活力及睪酮濃度的變化 口服攝入酒精15周后，小鼠附睪中的精子數目明顯降低[(394±64)×106/ml比(221±55 )×106/ml]，(P<0.05)。見圖1A；精子活力明顯下降[(54±13)%比(23±8)%](P<0.05)。見圖1B。血清和睪丸中睪酮明顯下降[血清：(1.234±0.242)μg/L比(0.657±0.260)μg/L](P<0.05)；[睪丸：(1.784±0.242)μg/L比(0.894±0.181)μg/L](P<0.05)。見圖2。

注：與對照組比較aP<0.05圖1 口服攝入酒精15周后，附睪中精子數目和精子活力降低

注：與對照組比較aP<0.05圖2 口服攝入酒精15周后，睪丸組織中和血清中睪酮濃度降低

2.2 睪丸中NO和OONO-含量的變化 口服攝入酒精15周后，小鼠睪丸中NO含量明顯增加[(117±22)μmol/g比(253±35)μmol/g](P<0.05)。見圖3A；OONO-生成明顯增加[(5.32±1.12)μmol/(g·min)比(11.72±2.64)μmol/(g·min)](P<0.05)。見圖3B。Western blot檢測結果顯示睪丸中eNOS蛋白表達變化不明顯(0.93±0.09比1.00±0.11)(P>0.05)，iNOS蛋白的表達(3.24±0.43比1.00±0.14)(P<0.05)和nNOS表達(1.87±0.26比1.00±0.12)(P<0.05)明顯增加。見圖4。

注：與對照組比較aP<0.05圖3 口服攝入酒精15周后，睪丸中NO含量和OONO-生成增加

注：與對照組比較aP<0.05圖4 口服攝入酒精15周后，睪丸中nNOS、eNOS和iNOS蛋白表達的變化

3 討論

本研究的結果發現，長期的高劑量酒精攝入導致小鼠精子損傷嚴重，精子生成數目減少，活力降低，睪酮的合成降低，這一系列數據證明酒精攝入的確對成年雄性小鼠生殖系統造成明顯的損傷。

進一步的研究還發現長期的高劑量酒精攝入后，睪丸中NO含量明顯增加，而其起因是iNOS和nNOS蛋白表達水平的增加。

NO是一種極不穩定的化合物，實驗條件下的半衰期大約3～5 s，高度脂溶性，極易通過生物膜，可自由擴散進入周圍的靶細胞，對于調節哺乳動物生殖系統功能具有極其重要的作用[3-5]。

NO對成年雄性小鼠生殖系統的影響主要通過2種途徑。首先，過多的NO一方面會與過氧化物反應生成OONO-，導致精子細胞膜脂質氧化造成損傷，另一方面它也會抑制細胞三羧酸循環系統的一系列酶的活性，從而抑制細胞的有氧呼吸[6-7]。其次，NO是睪酮的負向調控因子，睪丸中NO合成增加，會抑制睪丸間質細胞的睪酮分泌能力[8-9]，從而減少小鼠體內睪酮水平，間接抑制了成年雄性小鼠生殖系統的功能。臨床試驗發現在無精癥患者睪丸中iNOS表達水平異常高[10]，也從另一方面暗示了長期的酒精攝入誘導的iNOS表達增加對精子生成的潛在危險。nNOS/NO被報道主要參與對血睪屏障中細胞間緊密連接的調控，而過多的NO會破壞血睪屏障中細胞間緊密連接[11]，從而進一步損傷睪丸的功能。

綜上所述，長期的酒精攝入后，成年雄性小鼠睪丸中iNOS和nNOS蛋白表達增加，睪丸中NO合成增加，因為NO的精子毒性作用和抑制睪酮分泌作用，從而最終導致了成年雄性小鼠生殖系統功能的損傷。

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(本文編輯：彭潤松)

Mechanism of alcohol-induced damage involving nitric oxide in the reproductive system of male mice

GongJianjun,SunJunfeng,ZhangZhongming,ZhuJianming

(GulangyuSanatorium,NanjingMilitaryAreaCommand,Xiamen361002,China)

Objective To investigate the underlying mechanism of alcohol-induced damage involving nitric oxide (NO) in the reproductive system of male mice.Methods C57BL/6J male mice (10 weeks old) were randomly divided into 2 groups: the control group (orally treated with 10% sucrose daily for 15 weeks) and the alcohol group (orally treated with 8 g/kg daily for 15 weeks). Fifteen weeks later, epididymises were collected for the observation of sperm number and activity. At the same time, blood samples were taken to detect the level of serum testosterone. Testes were also collected for the detection of serum testosterone levels, the levels of NO and OONO-, as well as the expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), and neural nitric oxide synthase (nNOS). Results As compared with that of the control group (221±55)×106/ml)(P<0.05), the number of sperms in the animals of the alcohol group was obviously decreased (394±60)×106/ml) (P<0.05), and the activity (P<0.05) of sperms in the animals of the alcohol group was also decreased (54±13)%, as compared with(23±8)% of the control group(P<0.05). Laboratory tests also revealed that the levels of testosterone in serum and testes were all decreased (P<0.05). The levels of NO and OONO-were all increased in the alcohol-treated mice (P<0.05), and the expression levels of iNOS and nNOS were also up-regulated in the testes of the alcohol-treated mice.Conclusion Enhanced synthesis of NO in the testis of male mice following prolonged consumption of alcohol was one of the important mechanisms involved in the injury of the reproductive system of adult male mice.

Alcohol; Nitric oxide; Male reproductive system; Mouse

361002 福建 廈門，南京軍區鼓浪嶼療養院(龔建軍、張忠明、朱建明)；福建省軍區廈門警備區醫院(孫俊峰)

張忠明，電子信箱：123014617@qq.com

R697

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2015.05.012

2014-11-26)