1H NMR檢測技術結合PCA及OPLS在SLE疾病發生、發展中的應用研究

彭華明 王悅寧 王艷梅

1H NMR檢測技術結合PCA及OPLS在SLE疾病發生、發展中的應用研究

彭華明 王悅寧 王艷梅

目的 了解1H NMR檢測技術結合模式識別技術-主成分分析法（PCA）及正交偏最小二乘法方法(OPLS)在系統性紅斑狼瘡（SLE）疾病發生、發展中的應用價值。方法 采用瑞士Bruker 600MHzNMR譜儀，對34例健康志愿者（對照組）與62例SLE患者（觀察組）血清樣本進行檢查，基于把握代謝物差異基礎上取代謝物指紋圖譜，綜合模式識別分析方法，建立SLE診斷模型。結果 SLE對氨基酸、脂類、能量代謝具有影響作用。PCA可對觀察組與對照組進行區分，PLS-DA模型預測率達0.393，OPLS-DA模型診斷特異性達97.1%左右，敏感性達60.9%左右。結論 利用1H NMR檢測技術及PCA及OPLS，強化SLE疾病監測，能夠指導臨床治療，改善患者預后。

1H NMR檢測技術；PCA；OPLS；SLE疾病

SLE作為臨床上一種常見的自身免疫性疾病，多表現為免疫性炎癥，易波及多器官、多系統，目前病因尚未完全清晰，根治療法欠缺[1]。近年來，伴隨著基因組技術的不斷發展，應用微陣列技術對SLE外周血基因表達譜進行研究，篩選SLE有關基因，證實臨床免疫表型譜與SLE基因表達譜具有關聯性[2]。本研究選取健康志愿者與SLE患者外周血清樣本中的內源性代謝物，立足于機體病理變化角度，綜合1H NMR檢測技術及 PCA與OPLS等分析方法，探究SLE疾病發生、發展過程，旨在分析代謝組學在SLE發病機制中的應用價值。相關報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇坪山新區人民醫院于2012年3月～2014年3月收治的62例SLE患者為觀察組，與1997年美國風濕病學制定的SLE臨床診斷標準吻合，其中男12例，女50例，年齡22～65歲，平均(45.67±4.78)歲。另擇取同期來體檢的

34例健康志愿者為對照組，男9例，女25例，年齡21～68歲，平均(47.78±3.05)歲。2組患者年齡、性別等一般資料對比差異無統計學意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 采集標本方法 嚴格執行規范程序，于清晨抽取外周靜脈血3mL，置入生化管內，待靜置0.5h后，采用3000r/ min的速度離心10min后留取500μL上清液，置入冰箱（-80℃）內保存。

1.2.2 檢測方法 待室溫凍融標本后留取血清200μL溶于重水200μL中。將核磁管（5mm）置入混合液中，在瑞士Bruker 600MHzNMR譜儀上進行樣本一維及二維氫譜，開展維水峰抑制實驗，擇取標準預飽，并選擇壓水NOESY1DPR序列，RD（弛豫延遲）設置為2.5s，tm（混合時間）設置為100ms，累記次數達128次，對RD與tm進行對水處理，做好飽和照射。采集時間約0.95s，溫度維持25℃，譜寬達8384Hz。

1.3 統計學方法 采用TopSpin軟件傅立葉變換譜圖，并進行相位調整、定標處理等，同時對代謝物進行鑒定與量化處理，建立指紋圖譜，采用模式識別分析法構建并驗證LN與SLE診斷模型。

2 結果

2.11H NMR圖譜分析 經由檢測發現，觀察組譜圖與對照組譜圖具有相似點，其差異信號主要為氨基酸與脂肪區域，其中關鍵差異代謝物源于某些脂質代謝片段，包括L10、L9、L8、L7、L6。而高密度脂蛋白、磷酸膽堿、膽固醇水平出現下降，極低密度脂蛋白（包括L5、L3）與低密度脂蛋白（包括L2、L4）水平呈上升態勢，生糖氨基酸（包括谷氨酸、纈氨酸、酪氨酸、丙氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸）及生酮水平呈下降趨勢，其他代謝物（包括肌氨酸酐、丙酮酸、檸檬酸、甲酸、谷氨酸鹽、肌酸）信號衰退。

2.2 PR變化分析 依據PCA分析結果，構建PC1與PC2得分圖，其中PC1占總變量的76.6%，PC2占總變量的10.9%，區分觀察組與對照組，獲取PLS-DA模型得分圖，經由排序驗證（200次）獲取最終驗證圖。結合OPLS-DA診斷模型得分圖，可觀察組間的差異性，其對疾病的敏感性為60.9%左右，特異性達97.1%左右。

3 討論

隨著醫療水平的不斷發展，代謝組學技術在臨床研究上得到廣泛推廣，多以NMR為依據，綜合模式識別分析方法，建立機體代謝指紋圖譜，可對疾病病理狀態進行詳細區分，與單一標志物相比較，其對疾病診斷更具有應用價值[3]。

本研究以SLE患者為研究對象，通過構建血清代謝物指紋圖譜，深入探究疾病診斷方法，依據NOESY1DPR譜圖可得，SLE患者與正常人群血清代謝物差異多表現在氨基酸與脂質區域。針對脂質區域而言，HDL出現下降現象，且VLDL、LDL呈上升態勢，與以往研究具有一致性，充分表明SLE極其容易誘發脂質代謝失衡。一般而言，針對SLE患者而言，其血清氨基酸水平出現下降現象，其中涵蓋生酮（氨基酸）、生糖、檸檬酸（三羧酸循環中間代謝產物）均呈下降態勢，同時丙酮酸（糖酵解中間產物）亦減少，表明SLE患者能量代謝處于失衡狀態。究其根源，可能由于增強蛋白質分解代謝后，基于炎癥狀態下，導致能量需求上升[4-6]。相關文獻報道指出，針對SLE與RA患者而言，其血清中的組氨酸水平與正常人比較，呈下降態勢[7-9]。由此可見，以往單一代謝物無法成為SLE特異標志物，基于把握代謝物改變信息基礎上，才能對SLE患者疾病狀態進行區分。

本研究結合模式識別分析方法，對收集的代謝物信息進行綜合判斷后經由PCA得分圖提示，正常人群與SLE患者區分明顯，表明在血清代謝物輪廓上，健康人群與SLE患者差異顯著。而結合PLS-DA得分圖對此進行驗證，模型預測率為0.393，充分證實這一結論的準確性。為了避免非實驗因素對其形成干擾，故對PLS-DA得分圖進行正交濾噪處理，獲取OPLS-DA得分圖，可對健康人群與SLE患者進行最優化區分，凸顯2組差異性，模型驗證特異性與敏感性較高[10]。本研究結果提示，綜合血清差異代謝物建立診斷模型，可對健康人群與SLE患者進行區分，得分圖提示代表健康人群的點處于集中狀態，而SLE組呈離散狀態，可能由于SLE出現活動期與緩解期，加上易誘發系統并發癥，故表現于此，有待后續強化驗證[11]。

整體上來講，綜合代謝組學技術分析SLE患者外周血清標本，可區分正常人與SLE患者血清的代謝輪廓。結合模式識別分析方法，強化海量數據綜合分析，可對正常人與SLE患者進行區分，從而構建敏感性與特異性均高的診斷模型，表明代謝組學已成為了一種全新的SLE診斷方法，可研究SLE發病機制，補充基因與轉錄組成果[12]。

綜上所述，1H NMR檢測技術結合PCA及OPLS在SLE發病機制研究中具有重要的應用價值，值得臨床推廣與應用。

[1] 洪楷,沈偉濤.表面加強激光解吸電離-飛行時間-質譜技術及其在系統性紅斑狼瘡診斷中的研究進展[J].汕頭大學醫學院學報,2011（2）∶121-123.

[2] 歐陽昕,文錦麗,彭武建,等.應用代謝組學方法構建系統性紅斑狼瘡診斷模型[J].中國現代醫學雜志,2011（23）∶2878-2881.

[3] 胡金波,谷恒存,丁志山,等.基于LC-MS的系統性紅斑狼瘡小鼠的代謝組學研究[J].浙江中醫藥大學學報,2012（12）∶1325-1329.

[4] 宋雅楠,張永煜,蘇式兵.代謝組學在“病證效”結合研究中的應用[J].世界科學技術(中醫藥現代化),2013（4）∶628-633.

[5] 胡金波,谷恒存,范永升,等.解毒祛瘀滋陰方治療系統性紅斑狼瘡小鼠的代謝組學研究[J].中華中醫藥雜志,2014（1）∶60-65.

[6] 買吾拉尼江·依孜布拉.基于NMR代謝組學法研究異常黑膽質成熟劑對異常黑膽質型Ⅱ型糖尿病大鼠的作用機制[D].烏魯木齊∶新疆醫科大學,2013.

[7] 孫繼明.肌張力障礙疾病代謝組學的診斷探索及頸動脈外膜剝脫手術前后小分子代謝物的差異[D].西安∶第四軍醫大學,2013.

[8] 王斌.白細胞介素-10基因5'端側翼區單核苷酸多態性及其單倍型與系統性紅斑狼瘡易感性的相關性研究[D].合肥∶安徽醫科大學,2013.

[9] 蘇勵,姚重華,茅建春,等.風濕病“同病異治”病證相關性的代謝組學研究[A]//中國中西醫結合學會風濕病專業委員會.全國第八屆中西醫結合風濕病學術會議論文匯編[C].中國中西醫結合學會風濕病專業委員會,2010∶5.

[10] 俞穎,曹毅,陳益民,等.基于液相色譜-質譜聯用系統的系統性紅斑狼瘡患者血漿代謝組學分析[J].色譜,2010（7）∶644-648.

[11] 牛曉昶,曾照芳.蛋白質組學在系統性紅斑狼瘡診斷及治療中應用的研究[J].激光雜志,2010（6）∶84-86.

[12] 張少然.T輔助細胞亞群聯合檢測對系統性紅斑狼瘡病情評估價值的研究[D].太原∶山西醫科大學,2011.

doi∶10.3969/j.issn.1009-4393.2015.13.028

廣東 518118 廣東省深圳市坪山新區人民醫院內科 （彭華明 王悅寧） 518000 廣東省深圳市龍華新區中心醫院ICU （王艷梅）