植入性門靜脈主干癌栓兔模型建立及評(píng)估

張 雯， 李 說(shuō)， 顏志平， 羅劍鈞， 劉清欣， 瞿旭東， 王建華

肝細(xì)胞肝癌（HCC）是臨床最常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球惡性腫瘤第6位，死亡率居第3位［1］；在國(guó)內(nèi)的發(fā)病率僅次于肺癌占第2位。HCC起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)通常已無(wú)法手術(shù)切除。伴有門靜脈癌栓（PVTT）患者易并發(fā)上消化道出血、頑固性胸腹水等，預(yù)后極差，其自然病程僅為2.7～4個(gè)月；門靜脈主干癌栓（MPVTT）形成是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素［2-3］。

動(dòng)物模型是研究疾病病理生理機(jī)制，評(píng)價(jià)臨床治療效果及安全性的基礎(chǔ)。目前已成功建立HCC動(dòng)物模型，如Buffalo大鼠HCC模型、新西蘭大白兔肝移植VX2腫瘤模型［4］等，但目前仍缺乏可重復(fù)地用于病理機(jī)制及療效研究的HCC PVTT動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)旨在建立穩(wěn)定的可用于評(píng)估療效的植入性MPVTT動(dòng)物模型，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株 本實(shí)驗(yàn)已獲得復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。取健康新西蘭大白兔27只，體重1.8～2.2 kg，雌雄不限。3只為荷瘤兔，其余隨機(jī)分為對(duì)照組（A組，10只）和實(shí)驗(yàn)組（B組，14只）。實(shí)驗(yàn)前所有兔均稱重。采用VX2瘤株。1.1.2 主要儀器及器械 64排螺旋CT（LightSpeed VCT，美國(guó)通用公司）、顯微手術(shù)器械與普通手術(shù)器械包 （我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室）、5-0/6-0血管縫線（上海浦東金橋醫(yī)療器械廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物麻醉與母瘤建立 常規(guī)消毒后，肌內(nèi)注射氯胺酮-地西泮混合液（按4︰2比例配制，注射量為1.5 ml/kg）麻醉動(dòng)物。自液氮罐取出VX2瘤株，復(fù)蘇后PBS液沖洗、離心、棄上清液，加入DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋，取1 ml注入兔后腿背側(cè)皮下成瘤，2～3周待腫瘤長(zhǎng)至直徑約2.0 cm時(shí)備用。

1.2.2 MPVTT模型建立 荷瘤種兔麻醉后，固定、消毒鋪巾，取瘤體近邊緣?mèng)~肉樣無(wú)壞死區(qū)。用眼科剪將瘤塊修剪成約1.0 mm×1.0 mm×8.0 mm的瘤長(zhǎng)條，頭端用縫線固定，穿入18 G針頭內(nèi)，浸泡于DMEM培養(yǎng)液，置于冰盒上備用。實(shí)驗(yàn)組兔麻醉后，仰臥位固定、消毒鋪巾，劍突下逐層開腹，充分顯露、游離門靜脈主干，置入保護(hù)線；用6-0血管縫線在門靜脈主干前壁縫直徑約2 mm荷包，用已備好的帶瘤條注射器經(jīng)荷包中央將瘤條注入門靜脈腔內(nèi)，然后輕輕提起遠(yuǎn)端保護(hù)線阻斷血流、退針，同時(shí)收緊荷包并打結(jié)，外拉瘤條縫線，確保瘤塊固定于門靜脈主干內(nèi)壁；確認(rèn)無(wú)活動(dòng)性出血后，撤除保護(hù)線、關(guān)腹（圖1）。對(duì)照組兔僅開腹，在門靜脈主干前壁作2 mm荷包縫合。術(shù)后對(duì)所有兔連續(xù)用抗生素3 d，預(yù)防感染。

①開腹，暴露門靜脈，白箭頭為下腔靜脈，黑箭頭為門靜脈，表面有脂肪組織及胰腺組織包繞；②分離門靜脈，置入保護(hù)線；③門靜脈前壁作荷包縫合（白箭頭）；④將瘤條經(jīng)荷包中央注入門靜脈后收緊荷包并打結(jié)（箭頭示瘤條預(yù)留縫線）圖1 MPVTT建模過(guò)程

1.2.3 觀察指標(biāo) 觀察動(dòng)物術(shù)后精神、活動(dòng)、進(jìn)食、大便情況，體重變化及存活期。術(shù)后每周行胸腹部CT平掃和增強(qiáng)CT檢查，觀察MPVTT癌栓生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況。將數(shù)據(jù)傳至工作站重建，測(cè)量癌栓長(zhǎng)短徑。三維多平面重建（3D-MPR）門靜脈，獲取門靜脈橫斷位、矢狀位及冠狀位圖像。

1.2.4 大體標(biāo)本及病理學(xué)檢查 術(shù)后2周CT檢查后處死對(duì)照組A1、A2號(hào)兔和實(shí)驗(yàn)組B1～4號(hào)兔；術(shù)后4周處死對(duì)照組A3、A4號(hào)兔和實(shí)驗(yàn)組B5～8號(hào)兔。解剖觀察MPVTT與周圍臟器關(guān)系及轉(zhuǎn)移情況。取癌栓（包括門靜脈）、肝臟、部分肺組織，放入4%多聚甲醛溶液固定，送復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室作病理檢查。剩余兔觀察生存時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后動(dòng)物生物學(xué)行為改變及生存時(shí)間

所有實(shí)驗(yàn)兔手術(shù)均成功，無(wú)手術(shù)相關(guān)死亡。對(duì)照組兔除了術(shù)后第1、2天食欲減退、活動(dòng)減少外，飲食活動(dòng)無(wú)異常；無(wú)消瘦、腹瀉及惡液質(zhì)出現(xiàn)，體重隨著隨訪期延長(zhǎng)而增加，A5～10號(hào)兔術(shù)后第35天平均體重為（2.08±0.17）kg；所有兔生存良好。實(shí)驗(yàn)組兔術(shù)后第1、2天食欲減退、活動(dòng)減少，約3周開始出現(xiàn)腹瀉、食欲減退、體重下降，約5周出現(xiàn)惡液質(zhì)，B9～14號(hào)兔術(shù)后第35天平均體重為（1.48±0.19） kg，生存時(shí)間為 35～48 d，平均（41.7±4.7） d。

2.2 影像學(xué)檢查結(jié)果

術(shù)后第1周多排螺旋CT檢查顯示，實(shí)驗(yàn)組兔門靜脈主干內(nèi)均見小充盈缺損，成瘤率達(dá)100%，瘤栓隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大，并出現(xiàn)強(qiáng)化（術(shù)后第1周至第5周MPVTT最大橫徑平均值分別為3.1、5.6、12.5、19.6、40.3 mm）。第3周部分兔門靜脈周圍側(cè)支循環(huán)形成，部分出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，癌栓延伸至部分門靜脈左右分支；肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大增多，門靜脈癌栓向肝內(nèi)延伸。第5周部分兔出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，后腹膜及腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖2）。對(duì)照組兔門靜脈主干局部稍狹窄，余未見異常。

2.3 大體標(biāo)本及組織病理學(xué)檢查

2.3.1 大體標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第2周，門靜脈主干局部稍膨脹，肝內(nèi)門靜脈分支未見癌栓，肝肺未見轉(zhuǎn)移灶。第4周門靜脈主干周圍粘連，門靜脈主干被腫瘤組織占據(jù)，明顯向外周突出，周圍側(cè)支血管形成，門靜脈腔內(nèi)見米黃色癌栓組織，與門靜脈管壁粘連，癌栓向門靜脈分支延續(xù)；肝臟內(nèi)散在多個(gè)大小不等轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)；自然死亡兔明顯惡液質(zhì)，肝內(nèi)密布大小不等轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，門靜脈結(jié)構(gòu)顯示不清，肝門巨塊腫瘤與周圍肝臟、胃壁、腸壁、系膜粘連，并向間隙浸潤(rùn)。5/6兔（83.3%）肉眼可見肺內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，3/6兔（50.0%）見血性腹水，2/6兔（33.3%）見腸系膜轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，1/6兔（16.7%）見腹壁轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（圖3）。對(duì)照組門靜脈局部少許粘連，門靜脈主干局部狹窄，余未見異常。

2.3.2 組織病理學(xué)表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2周鏡下顯示門靜脈管腔內(nèi)見巢狀形態(tài)不規(guī)則腫瘤細(xì)胞，呈異型性，細(xì)胞核深染，大且不規(guī)則。部分節(jié)段的門靜脈內(nèi)膜上見單層腫瘤細(xì)胞黏附，與內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)合，內(nèi)皮細(xì)胞層保持相對(duì)完整。肝組織內(nèi)有散在小灶狀腫瘤細(xì)胞分布，肺內(nèi)未見轉(zhuǎn)移灶。術(shù)后第4周，癌栓與門靜脈管壁分界不清，緊靠血管面的腫瘤細(xì)胞核大，多倍體核多見，排列紊亂；中央?yún)^(qū)域有壞死。腫瘤細(xì)胞侵蝕門脈管壁，破壞門靜脈管壁內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，中膜受到腫瘤推擠，部分彈力纖維被腫瘤破壞，緊貼肝實(shí)質(zhì)側(cè)的彈力纖維相對(duì)完整，在彈力纖維內(nèi)可見較多腫瘤細(xì)胞形成的癌巢。肝組織內(nèi)有多個(gè)片狀腫瘤巢，中央見壞死；肺內(nèi)散在多灶瘤巢。自然死亡后，門靜脈主干結(jié)構(gòu)無(wú)法找到，被大量腫瘤組織及壞死組織代替；肝組織被大片腫瘤細(xì)胞占據(jù)，中央伴大片壞死無(wú)結(jié)構(gòu)區(qū)；肺內(nèi)多灶瘤巢，部分中央有壞死（圖3）。對(duì)照組未見異常。

3 討論

PVTT是HCC常見病理表現(xiàn)，發(fā)生率高達(dá)30%～60.2%［5-7］，不僅是HCC惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的主要原因，也是提高晚期HCC療效的重要障礙［8-10］。當(dāng)PVTT累及門靜脈主干，堵塞了腸道血液回流，肝臟缺血和門靜脈高壓加重，患者多在短期內(nèi)死于肝功能衰竭或食管胃底靜脈破裂出血［9-11］。Okazaki等［12］報(bào)道提示，伴有MPVTT的HCC患者5年生存率為0%～6%。

3.1 MPVTT模型建立

目前已建立多種誘發(fā)性HCC動(dòng)物模型，但這些模型的PVTT發(fā)生率均不高。Lindsay等［13］曾嘗試用致癌劑化學(xué)誘導(dǎo)法建立獼猴HCC PVTT模型，實(shí)驗(yàn)2.5年后建立首例獼猴HCC模型，10年共建立34例HCC模型，其中14例存在經(jīng)門靜脈系統(tǒng)播散轉(zhuǎn)移，可見靜脈內(nèi)癌栓，癌栓形成率僅為35%（14/40）。這是迄今為止唯一類似人HCC PVTT大型動(dòng)物模型。然而，由于獼猴屬于珍稀動(dòng)物，價(jià)格昂貴，模型操作復(fù)雜，制作周期長(zhǎng)，這一模型無(wú)法得到推廣。Genda等［14］報(bào)道將高轉(zhuǎn)移性 HCC細(xì)胞株 Li7和 KYN-2注入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，可在血管內(nèi)形成癌栓，但未發(fā)現(xiàn)MPVTT。

圖2 PVTT植入后不同時(shí)間多排螺旋CT表現(xiàn)

VX2腫瘤是源于Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的上皮細(xì)胞惡性腫瘤，屬于鱗狀細(xì)胞癌，具有較高的肝、肺轉(zhuǎn)移性，且血供豐富類似于HCC，目前已廣泛用于種植性HCC模型實(shí)驗(yàn)研究。萬(wàn)智勇等［15-16］采用B超引導(dǎo)穿刺或開腹直接穿刺門靜脈，經(jīng)3 F微導(dǎo)管向門靜脈內(nèi)注射0.5～1.0 mm3VX2腫瘤組織塊，門靜脈內(nèi)成瘤率分別為89%和94%。進(jìn)一步作ABS-丙酮門靜脈鑄型研究提示，植入性PVTT早期由門靜脈小分支供血，后期為肝動(dòng)脈和門靜脈雙重供血，這一結(jié)果也與人 HCCPVTT血供相符［17-18］。范偉等［19］報(bào)道采用開腹切開門靜脈主干前壁，通過(guò)將VX2腫瘤塊縫在血管內(nèi)壁建立MPVTT模型，成瘤率達(dá)100%，但由于是手術(shù)縫合，無(wú)法避免部分腫瘤組織暴露在門靜脈管壁外，因此較早發(fā)生門靜脈管壁外浸潤(rùn)。

本實(shí)驗(yàn)采用開腹門靜脈前壁荷包縫合，然后經(jīng)荷包中央注入VX2瘤條，通過(guò)將瘤條懸掛在門脈內(nèi)壁的方法制作MPVTT模型，成瘤率達(dá)到100%；術(shù)后4周癌栓仍位于門靜脈管腔內(nèi)生長(zhǎng)，且有沿管腔鑄型性延伸趨勢(shì)，避免了上述方法的缺點(diǎn)，較好地模擬癌栓血管內(nèi)生長(zhǎng)方式；實(shí)驗(yàn)組兔平均生存期為（41.7±4.72） d，與范偉等［19］的報(bào)道基本吻合，但明顯低于褚朝順等［20］報(bào)道的VX2肝內(nèi)移植性腫瘤模型平均生存期（55.56±2.28）d，并且較早發(fā)生多發(fā)轉(zhuǎn)移。分析其原因，在于瘤條植入在門靜脈主干生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞不停地脫落并轉(zhuǎn)移，加上3周后門靜脈主干完全阻塞引起的門靜脈高壓等，這也從另一方面印證了MPVTT是HCC易于產(chǎn)生肝內(nèi)播散病灶、預(yù)后極差的主要原因之一［21-22］。

圖3 大體標(biāo)本及病理學(xué)檢查結(jié)果

3.2 影像學(xué)評(píng)估

目前臨床上診斷PVTT主要依靠影像學(xué)手段［23-24］。本實(shí)驗(yàn)采用增強(qiáng)螺旋CT掃描，在癌栓植入1周檢出率（敏感性）就達(dá)100%，與2周及4周病理學(xué)檢查結(jié)果對(duì)照，準(zhǔn)確率（特異性）同樣達(dá)到100%；3D-MPR能充分顯示門靜脈主干及一二級(jí)分支；不僅如此，CT橫斷面掃描及3D-MPR結(jié)果均可以顯出門靜脈主干完全阻塞后特有的周圍側(cè)支血管建立；隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，癌栓顯示出管腔內(nèi)膨脹性生長(zhǎng)甚至管壁外浸潤(rùn)等特點(diǎn)，這也與臨床上CT鑒別癌栓與血栓的結(jié)果相符。

3.3 MPVTT生長(zhǎng)方式

本實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)懸掛于門靜脈血液中的瘤條可以存活并生長(zhǎng)形成附壁栓子，這一方面說(shuō)明腫瘤組織可直接從血液中汲取營(yíng)養(yǎng)，另一方面也印證了HCC PVTT 形成之“營(yíng)養(yǎng)學(xué)說(shuō)”［25］，即門靜脈血液中富含腸道吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，胰腺分泌的胰島素、胰高糖素等促生長(zhǎng)激素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，是HCC PVTT好發(fā)的原因之一；術(shù)后2周內(nèi)PVTT均無(wú)動(dòng)脈期強(qiáng)化，提示早期癌栓尚無(wú)動(dòng)脈參與供血，當(dāng)生長(zhǎng)超過(guò)4周后增強(qiáng)CT檢查時(shí)出現(xiàn)動(dòng)脈期癌栓邊緣強(qiáng)化，這進(jìn)一步說(shuō)明隨著PVTT體積增大，動(dòng)脈同樣參與了癌栓供血，這一結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道［7，26］相似。

本實(shí)驗(yàn)制作的MPVTT模型細(xì)胞學(xué)類型及生長(zhǎng)模式雖與人HCCMPVTT存在差異，但血供類型、肝內(nèi)播散及門靜脈主干閉塞后病理改變等與人HCC MPVTT有許多相似之處，且成瘤率高，因此可用于實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)不同治療方法對(duì)MPVTT的療效。

本實(shí)驗(yàn)成功建立穩(wěn)定的可供影像學(xué)客觀評(píng)價(jià)的MPVTT動(dòng)物模型，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同治療方法對(duì)MPVTT的療效打下基礎(chǔ)。結(jié)合病理結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)增強(qiáng)多排螺旋CT及3D-MPR對(duì)診斷及監(jiān)測(cè)PVTT生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有良好價(jià)值。

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