急性心肌梗死后抑郁大鼠前炎癥細胞因子腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β的變化規律

關梓桐 張文潔 李悅 李衛紅 杜慶紅 徐雅

傳統中醫認為“心主神明”即心主宰人的精神、意識和情志。并認為心主血脈，即血是心主神志的物質基礎，而周身之血脈為心所主，此觀點為心主神明提供了理論基礎。因此本研究團隊猜想，心臟疾病后患者精神神志是否會出現異常表現。目前臨床發現心肌梗死患者中30%～60%伴有中度抑郁，15%～20%伴有抑郁癥。又有證據表明心肌梗死預后不良在抑郁癥狀中占有很大比重［1］。抑郁癥可加速缺血性心臟病的進展和增加心血管病的發病率和死亡率，是心血管疾病的一種危險因素［2-5］。目前心梗后抑郁發生病理機制的最新研究認為，心梗后抑郁的發生與炎癥反應相關，但其機制尚不明確。另有研究顯示，應用抗炎藥如己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)可減少心肌梗死后腦邊緣系統的細胞凋亡［6］，從而進一步印證炎癥反應與心梗后抑郁的關系。為揭示心肌梗死后心腦神志的生物學關系及評估大鼠心肌梗死后前炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和白細胞介素(interleukin，IL)-1β的變化規律，本實驗以大鼠心肌梗死模型為切入點，觀察心肌梗死后大鼠行為變化特征與炎癥因子循環水平變化規律的關系。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

100只8周齡SPF級雄性Wistar大鼠，體質量200～220 g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:SYXK(京)2012-0001。于北京中醫藥大學動物中心嚴格按照北京中醫藥大學動物倫理委員會有關實驗動物倫理審查和管理規定進行。按照隨機的原則將100只動物分成4組，其中模型組(AMI group)40只，術后成活19只，死亡21只，成活率為47．50%，其中死亡大鼠死亡原因為術中或術后心律失常。給藥組(PTX group)35只，術后成活15只。假手術組(Sham group)15只。正常組(normal group，N group)10只。

1．2 主要實驗設備和儀器

心電圖解析系統SP-2006_LAN(北京軟隆生物技術有限公司);自發行為動物檢測系統(JLBehv-LAR-1，上海吉量軟件科技有限公司);強迫游泳分析系統(EthoVision XT，Noldus公司，荷蘭)。

1．3 實驗試劑

己酮可可堿(Enzo Life Sciences公司，批號:L 02465)。

1．4 心肌梗死動物模型建立

心肌梗死動物模型的建立，對比后參考Trueblood的方法［7］并在其基礎上予以改進，將Wistar大鼠用10%的水合氯醛(0．4 mL/100g)麻醉后，仰位固定于手術臺上，采用生物信號定量分析系統SP-2006_LAN(北京軟隆生物技術有限公司)記錄大鼠術前及術后標準體表心電圖。正中剃毛，碘酒常規消毒，手術刀正中切開，用止血鉗鈍性分離肋間肌肉，自左側4～5肋間開胸，暴露心臟，在肺動脈圓錐及左心耳之間，距左冠狀動脈起點2～3 mm處，用3～0無創縫合線結扎左冠狀動脈前降支，立刻將心臟送回胸腔，擠出胸腔內氣體，待心率及呼吸平穩后用5～0縫合線縫合，假手術組在心臟左冠狀動脈左前降支處穿線不接扎，余過程與模型建立相同。正常組不予以任何手術處理。術后模型組及假手術組大鼠肌注青霉素鈉注射液80 000 U/天，共3天，以防止感染。動物清醒后按常規飼養。模型成功標準為心電圖顯示Ⅱ導聯出現ST段弓背抬高0．2 mV以上(見圖1、圖2)。假手術組術后ST段的抬高不明顯(見圖3、圖4)。術后1～7天給藥組連續7天每日上午10點進行腹腔注射PTX(0．2 mL/100g)，模型組給等體積的生理鹽水。

1．5 行為學觀察

1．5．1 蔗糖水消耗實驗［8］蔗糖水消耗實驗于大鼠手術前，手術后2周進行。本實驗是以大鼠蔗糖水攝取量降低作為指標，用于評估大鼠快感缺乏［9-10］。實驗前48小時，訓練大鼠適應飲用蔗糖水。同時給予每只大鼠兩瓶水:一瓶為1%蔗糖水，一瓶為純凈水。大鼠禁食禁水24小時，而后在安靜避光的環境下進行蔗糖水消耗實驗。然后每籠分別給予已定量的蔗糖水(1%蔗糖水)和純凈水兩瓶液體，60分鐘后取走液體并分別稱重。蔗糖水消耗百分比=蔗糖水消耗量/總液體消耗量×100%

圖1 模型組術前心電圖

圖2 模型組術后10分鐘心電圖

圖3 假手術組術前心電圖

圖4 假手術組術后10分鐘心電圖

1．5．2 自發行為實驗 自發行為實驗所用裝置為不透明的材料所制成，箱體為正方體，通過箱體所帶攝像頭來觀察大鼠在箱體的運動狀態。根據參考文獻［11］，本實驗于大鼠手術后第2周進行。實驗時將大鼠輕慢置于中心方格內，關閉箱門，觀察大鼠在5分鐘內的活動總路程，活動總時間和站立次數。

1．5．3 強迫游泳實驗 本實驗為行為絕望實驗法，其基本原理為當大鼠放置在一個有限的空間使之游泳，觀察大鼠在水中的行為，大鼠不動時間越長，表示抑郁程度越高。本實驗于手術后30天進行，參考文獻［12-13］將每只大鼠于下午13:00在安靜狀態下分別置于水溫24～25℃，水深30 cm，21 cm×21 cm×50 cm的有機玻璃缸中，進行預游泳，每只大鼠游泳時間為15分鐘。24小時后進行正式游泳實驗。同時間，同條件下讓每只大鼠強迫游泳5分鐘，并同時使用強迫游泳分析系統(EthoVision XT，Noldus公司，荷蘭)記錄大鼠游泳時間、掙扎時間及不動時間并對指標進行分析。

1．6 組織學檢測

TNF-α，IL-1β在大鼠血漿內和腦組織內濃度。術后33天取材。用10%的水合氯醛(0．4 mL/100g)麻醉大鼠，腹主動脈取血4 mL，注入肝素鈉離心管并離心，取上清液，－80℃保存;斷頸法處死大鼠，取腦組織，將腦組織于－80℃保存。大鼠腹主動脈取血于用肝素鈉采血管內，離心機3000 rpm離心10分鐘，取上清液，大鼠腦組織勻漿。用Rat TNF-αElISA KIT試劑盒檢測(Multi Science)和Rat IL-1βElISA KIT試劑盒檢測(Multi Science)。

1．7 統計學處理

所有數據應用SPSS 20．0統計軟件包進行分析。數據以均數±標準差±s)表示。數據均服從正態分布，并采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較時采用LSD法，P＜0．05為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2．1 各組大鼠蔗糖水消耗實驗比較

各組大鼠蔗糖水消耗百分比經正態檢驗，均符合正態分布，方差齊性檢驗P＞0．05，組間兩兩比較采用LSD法。假手術與正常組相比，大鼠蔗糖水消耗百分比沒有明顯差異(P＞0．05)。模型組與假手術組相比，模型組大鼠蔗糖水消耗百分比明顯減少，差異有統計學意義(P＜0．05)。PTX組與模型組相比，PTX組大鼠蔗糖水消耗百分比明顯高于模型組大鼠，差異有統計學意義(P＜0．05)。見表1。

表1 心梗術后各組大鼠蔗糖水消耗百分比±s)

表1 心梗術后各組大鼠蔗糖水消耗百分比±s)

注:與假手術組相比，a P ＜0．05;與模型組相比，b P ＜0．05

組別 n 蔗糖水消耗百分比(%)10 84．55 ±9．93假手術組 11 84．44 ±8．43模型組 9 63．15 ±9．22a PTX 組 8 74．89 ±5．17正常組b

2．2 各組大鼠自發行為實驗比較

各組大鼠三項自發行為指標經正態檢驗，均符合正態分布，方差齊性檢驗P＞0．05，組間兩兩比較采用LSD法。假手術與正常組相比，大鼠的活動總路程，總時間和站立次數差異無統計學意義(P＞0.05)。模型組與假手術組相比，模型組大鼠的活動總路程，總時間和站立次數明顯減少，差異有統計學意義(P＜0．05)。PTX組和模型組相比，PTX組大鼠的活動總路程，總時間和站立次數明顯高于模型組大鼠，差異有統計學意義(P＜0．05)。見表2。

表2 心梗后各組大鼠自發行為實驗指標±s)

表2 心梗后各組大鼠自發行為實驗指標±s)

注:與假手術組相比，a P ＜0．05;與模型組相比，b P ＜0．05

組別 n 總路程(mm) 總時間(s) 站立次數(次)44假手術組 11 7570．42 ±3141．58 208．76 ±20．12 32．43 ±12．14模型組 9 908．03 ±896．88a 59．00 ±36．50a 3．17 ±4．36a PTX 組 8 3952．39 ±2384．53b127．80 ±47．40b 18．22 ±6．28正常組 10 10651．54 ±3006．80 184．61 ±51．82 40．71 ±20．b

2．3 各組大鼠強迫游泳實驗比較

各組大鼠強迫游泳三項指標經正態檢驗，均符合正態分布，方差齊性檢驗P＞0．05，組間兩兩比較采用LSD法。假手術組與正常組相比，大鼠的游泳時間，不動時間和掙扎時間差異無統計學意義(P＞0．05)。模型組與假手術組相比，模型組大鼠游泳時間和掙扎時間明顯減少，但不動時間增加，差異有統計學意義(P＜0．05)。PTX組與模型組相比，PTX組大鼠的游泳時間和掙扎時間明顯高于模型組大鼠，但不動時間明顯低于模型組大鼠，差異有統計學意義(P＜0．05)。見表3。

表3 心梗后各組大鼠強迫游泳實驗行為指標± s ，S)

表3 心梗后各組大鼠強迫游泳實驗行為指標± s ，S)

注:與假手術組相比，a P＜0．05;與模型組相比，b P＜0．05

10 172．41 ±6．88 40．77 ±4．77 88．12 ±24．48假手術組 11 152．70 ±7．78 61．04 ±4．90 29．00 ±8．37模型組 9 10．38 ±4．26a 290．92 ±7．26a 0．51 ±0．56a PTX 組 8 32．41 ±7．35b 125．30 ±8．11b 5．56 ±3．71游泳時間 不動時間 掙扎時間正常組組別 n b

2．4 各組大鼠血漿內IL-1β 和TNF-α 濃度

各組大鼠血漿內IL-1β和TNF-α濃度經正態檢驗，均符合正態分布，方差齊性檢驗P＞0．05組間兩兩比較采用LSD法。假手術組與正常組相比，大鼠血漿內IL-1β和TNF-α濃度無統計學意義(P＞0.05)。模型組與假手術組相比，模型組大鼠血漿內IL-1β和TNF-α濃度均增加，差異有統計學意義(P＜0．05)。PTX組和模型組相比，PTX組大鼠血漿內IL-1β和TNF-α濃度均低于模型組大鼠，差異有統計學意義(P＜0．05)。見表4。

表4 心梗后各組大鼠血漿內IL-1β和TNF-α濃度指標±s)

表4 心梗后各組大鼠血漿內IL-1β和TNF-α濃度指標±s)

注:與假手術組相比，a P ＜0．05;與模型組相比，b P ＜0．05

組別 n IL-1β TNF-α 10 106．26 ±13．18 499．00 ±71．42假手術組 11 117．19 ±17．91 478．31 ±191．71模型組 9 147．91 ±24．35a 708．37 ±81．31a PTX 組 8 130．41 ±13．24b 615．87 ±55．66正常組b

2．5 各組大鼠腦內IL-1β 和TNF-α 濃度

各組大鼠腦內IL-1β和TNF-α濃度經正態檢驗，均符合正態分布，方差齊性檢驗P＞0．05，組間兩兩比較采用LSD法。假手術組與正常組相比，大鼠腦內 IL-1β和 TNF-α濃度無統計學差異(P＞0.05)。模型組和假手術組相比，模型組大鼠腦內IL-1β和TNF-α濃度均增加，差異有統計學意義(P＜0．05)。PTX組和模型組相比，PTX組大鼠腦內IL-1β和TNF-α濃度均低于模型組大鼠，差異有統計學意義(P＜0．05)。見表5。

表5 心梗后各組大鼠腦內IL-1β和TNF-α濃度指標(±s)

表5 心梗后各組大鼠腦內IL-1β和TNF-α濃度指標(±s)

注:與假手術組相比，a P ＜0．05;與模型組相比，b P ＜0．05

組別 n IL-1β TNF-α 10 31．88 ±11．37 74．17 ±9．54假手術組 11 51．36 ±8．06 103．37 ±12．57模型組 9 76．16 ±6．92a 147．03 ±15．90a PTX 組 8 62．49 ±8．07b 116．03 ±9．63正常組b

3 討論

傳統中醫認為識神是指人的精神意識思維活動，是以人的意志為轉移的，大腦的后天活動，本源于大腦卻隸屬于心，這是由于心主血脈為大腦的識神活動提供了物質基礎。目前臨床統計表明心血管疾病并發情緒障礙的概率為8% ～44%［14］。抗抑郁藥對心肌梗死的治療療效甚微，因此探求心肌梗死后抑郁相關病理機制尤為重要。目前在急性心梗模型的基礎研究中，慢性輕度不可預見性應激抑郁模型是目前較為理想的抑郁動物模型之一［15-16］。根據參考文獻，抑郁癥動物模型至少應符合3個標準［17］:(1)表觀信度:例如動物的行為特點看上去是否象人類的抑郁癥;(2)內在信度:引起行為改變的原因和因果關系是否和抑郁癥一樣;(3)預測信度:對人類有效的抗抑郁藥是否能可靠地改變動物的這種行為。本實驗結果表明大鼠冠狀動脈前降支結扎2周后，模型組大鼠與正常組和假手術組大鼠相比，蔗糖水偏好顯著減少，表明大鼠快感缺乏;自發行為實驗中大鼠的活動總路程、總時間、直立次數均明顯減少，表明大鼠的活動度和對外界新鮮環境的好奇度明顯下降;游泳時間和掙扎時間明顯減少，不動時間增加，表明大鼠具有絕望行為。以上大鼠產生快感缺乏，活動能力下降，產生絕望行為與抑郁癥的核心癥狀(心情低落、興趣缺乏等)有一定程度的相似性，類似抑郁癥患者的癥狀，因此可以判定大鼠在急性心肌梗死后產生了抑郁行為。

目前心肌梗死后抑郁的發生機制尚未明確，有研究表明，心肌梗死與炎癥反應密切相關。心肌局部及全身的炎癥反應，影響心肌梗死的病理及預后，并最終導致心肌重塑和疤痕形成。心肌梗死后，由免疫導致的炎癥反應，包括補體激活、細胞因子釋放、炎癥和免疫細胞趨化和浸潤，可加重心肌損傷和擴大心肌梗死的范圍。前炎癥細胞因子的釋放與心梗后抑郁的發病病理有關［18-19］。與心肌組織細胞因子濃度升高相平行的是，心梗后腦組織當中細胞因子的濃度也急劇增加［20］。因此本研究可以提出假設在急性心梗使得前炎癥細胞因子(如IL-1β、TNF-α)被激活并釋放入血，隨血液循環透過血腦屏障進入腦組織，刺激腦內神經元，小膠質細胞和血管內皮細胞進一步釋放前炎癥細胞因子如TNF-α和IL-1β等，引起腦內炎癥從而誘發抑郁的產生。根據上述實驗結果，模型組大鼠與假手術組大鼠和正常組大鼠相比，其血漿內和腦內IL-1β濃度和TNF-α濃度均明顯升高，從而可印證本研究提出的假設。

PTX是甲基黃嘌呤衍生物，是一種非特異性磷酸二酯酶抑制劑，具有抗炎抗纖維化特性，可通過cAMP依賴機制降低促炎細胞因子循環水平，如TNF-α、IL-1β 等［21］。有研究證明 PTX 可能通過改變促炎細胞因子水平從而衰減抑郁行為。據報道促炎細胞因子可誘發抑郁樣行為和細胞凋亡。例如:IL-1β 可提高 HPA活性［22］，并且誘發抑郁行為［23-25］，而 IL1-β 在抑郁癥患者循環濃度升高，且IL-1β拮抗劑可抑制IL-1β活性，由此可以認為PTX可減少炎性細胞因子。本實驗研究數據表明，PTX可通過抑制炎癥因子循環水平而緩解心梗后抑郁的癥狀，從而印證炎癥反應可能是心梗后抑郁發生的可能機制這一猜想。

本研究采用冠狀動脈前降支結扎方法建立大鼠急性心肌梗死模型，并通過行為學實驗和組織學檢測研究表明大鼠在心肌梗死后出現快感缺乏，活動度低下，絕望行為等抑郁行為，且模型組大鼠血漿內和腦內炎癥因子IL-1β和TNF-α濃度明顯升高。并采用PTX予以治療。結果表明PTX組大鼠與模型組大鼠相比，不但血漿內和腦內炎癥因子IL-1β和TNF-α循環水平濃度降低，且包括蔗糖水偏好顯著升高;活動總路程、總時間、直立次數和直立時間均明顯升高，游泳時間和掙扎時間明顯升高，不動時間顯著減少在內的抑郁行為顯著減輕，提示炎癥反應可能是心梗后抑郁發生的可能機制。

本實驗研究急性心肌梗死后產生的炎癥因子通過血液循環進入腦組織從而引起腦內炎癥而產生抑郁，但目前研關于炎癥因子如何改變血腦屏障通透性的機制仍尚未明確，希望通過建立更詳細的實驗來研究心梗后抑郁的炎癥機制。

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