黃芪當(dāng)歸對(duì)藥對(duì)特發(fā)性肺纖維化小鼠生存狀況及組織修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

李麗君　范盎然　葛東宇　吳謙　王淑艷　李根茂　陳萌　李麗娜

?

·論著·

黃芪當(dāng)歸對(duì)藥對(duì)特發(fā)性肺纖維化小鼠生存狀況及組織修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

李麗君范盎然葛東宇吳謙王淑艷李根茂陳萌李麗娜

【摘要】目的觀察不同劑量與配伍比例的黃芪、當(dāng)歸對(duì)藥對(duì)特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis， IPF)小鼠生存率、體質(zhì)量及組織修復(fù)相關(guān)基因c-kit原癌基因及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF2)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)表達(dá)水平的影響，并探討其相互關(guān)系及保護(hù)機(jī)制。方法SPF級(jí)ICR雄性小鼠80只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組，以及6個(gè)中藥治療組(大劑量黃芪50 g當(dāng)歸10g組、大劑量黃芪30 g當(dāng)歸30 g組、大劑量黃芪10 g當(dāng)歸50 g組、小劑量黃芪25 g當(dāng)歸5 g組、小劑量黃芪15 g當(dāng)歸15 g組、小劑量黃芪5 g當(dāng)歸25 g組)，除正常對(duì)照組外，其余各組采用氣管內(nèi)注射博萊霉素(5 mg/kg)復(fù)制小鼠肺纖維化模型，于28天處死小鼠，采用real time-PCR法檢測(cè)組織修復(fù)相關(guān)基因c-kit、FGF2及VEGF表達(dá)水平，HE染色及武兆發(fā)簡(jiǎn)化Mallory氏染色，觀察肺組織形態(tài)變化。結(jié)果HE染色及武兆發(fā)簡(jiǎn)化Mallory氏染色顯示，6個(gè)中藥治療組較模型組均有所改善，其中中藥治療第1、6組改善明顯，肺泡結(jié)構(gòu)已基本恢復(fù)。第28天時(shí)，與模型組比較，各組小鼠體質(zhì)量均呈上升的趨勢(shì)，中藥第1組小鼠體質(zhì)量上升趨勢(shì)較大(P<0.05)。28天死亡率，中藥治療組小鼠的死亡率較模型組降低，其中第1組死亡率與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組c-kit、FGF2、VEGFmRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論從小鼠的生存率與體質(zhì)量變化及病理形態(tài)觀察，大劑量黃芪當(dāng)歸5∶1組能明顯改善小鼠的生存質(zhì)量，其作用機(jī)制可能與抑制VEGF mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn)c-kit及FGF2 mRNA的表達(dá)水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肺纖維化；黃芪；當(dāng)歸；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

肺纖維化是多種急慢性肺病發(fā)展到一定階段的共同結(jié)果，特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)屬于肺間質(zhì)性疾病的一種，主要表現(xiàn)為肺組織的損傷與異常修復(fù)，對(duì)于IPF的發(fā)病機(jī)制和原因目前尚未完全闡明。支氣管肺泡干細(xì)胞(bronchioalveolar stem cells，BASCs)由Kim于2005年首次報(bào)道[1]。BASCs具有分化成肺泡II型上皮細(xì)胞和肺泡I型上皮細(xì)胞的能力[2]，參與肺組織的穩(wěn)態(tài)維持和損傷修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)從肺纖維化小鼠生存率BASCs存活關(guān)鍵基因c - kit原癌基因及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF2)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)表達(dá)水平的變化，探討不同配比與劑量的黃芪當(dāng)歸對(duì)IPF小鼠的保護(hù)機(jī)制。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)ICR雄性小鼠80只，體質(zhì)量18~22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、以及6個(gè)中藥治療組C組：大劑量黃芪50 g、當(dāng)歸10 g；D組：大劑量黃芪30 g、當(dāng)歸30 g；E組：大劑量黃芪10 g、當(dāng)歸50 g；F組：小劑量黃芪25 g、當(dāng)歸5 g；G組：小劑量黃芪15 g、當(dāng)歸15 g；H組：小劑量黃芪5 g、當(dāng)歸25 g。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物實(shí)驗(yàn)用中藥配方顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)，鹽酸博萊霉素(日本化藥株式會(huì)社)，將博萊霉素用生理鹽水配制成5 mg/mL的溶液。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑GIO-3A型高速冷凍離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，PCR儀(PE公司)，紫外分光光度計(jì)(Beck men公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶(Promega公司)，SYBR Green Supermix(BIO-RAD公司)。

1.2　方法

1.2.1動(dòng)物模型制備參考文獻(xiàn)方法[3]制備小鼠肺纖維化模型：將各組小鼠用10%水合氯醛按小鼠體質(zhì)量0.004 mL/g進(jìn)行腹腔注射麻醉。縱向剪開頸部皮膚，暴露氣管，在第一、二氣管環(huán)之間緩緩注入博萊霉素(5 mg/kg)，立即將動(dòng)物直立旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺部均勻分布，手術(shù)縫合。

1.2.2給藥方法造模第二天起，6個(gè)中藥治療組給予中藥水煎液灌胃治療，灌胃劑量為0.1 mL/10 g。模型組和正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。每周稱重后調(diào)整給藥劑量，各組連續(xù)灌胃28天。

1.2.3標(biāo)本收集與處理小鼠于給藥后第28天腹主動(dòng)脈放血處死，迅速開胸，切下右肺中葉，Trizol法提取肺組織總RNA，real time-PCR法檢測(cè)c-kit原癌基因及FGF2和VEGF表達(dá)水平。右下肺葉用4%的多聚甲醛溶液固定72小時(shí)，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋后制成石蠟切片，用于HE染色及武兆發(fā)簡(jiǎn)化Mallory氏膠原染色，觀察肺組織形態(tài)變化與膠原含量變化。

1.3　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2結(jié)果

2.1　小鼠一般形態(tài)

對(duì)照組小鼠造模后皮毛光亮如初，活潑好動(dòng)，肌肉豐滿，食欲旺盛，呼吸平穩(wěn)，體質(zhì)量逐漸增加，該狀態(tài)一直持續(xù)；模型組小鼠造模后，絕大部分出現(xiàn)精神萎靡，行動(dòng)緩慢，身體逐漸佝僂消瘦，食欲不振，皮毛逐漸暗淡枯搞，體溫降低，呼吸急促；中藥治療組中，C、E、H組小鼠較其他組精神狀態(tài)良好，活動(dòng)基本正常，皮毛光亮，食欲旺盛，呼吸平穩(wěn)，接近對(duì)照組；D、F、G組造模后小鼠精神、食欲尚可，部分小鼠出現(xiàn)皮毛稀疏枯槁，活動(dòng)量減少及消瘦，狀態(tài)不及成模前期，但較模型組稍好。

2.2　小鼠體質(zhì)量變化情況

稱量各組小鼠第0天、7天、14天、21天、28天體質(zhì)量，結(jié)果見表1。第7天時(shí)，除中藥治療E、F組外，其他各組小鼠體質(zhì)量均呈下降的趨勢(shì)。中藥第C、E組體質(zhì)量高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)；第14天時(shí)，各組小鼠體質(zhì)量均呈上升的趨勢(shì)，但均低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。第21天時(shí)，除模型組和中藥治療H組外，其余各組小鼠體質(zhì)量均呈上升趨勢(shì)，但仍低于對(duì)照組，其中中藥治療C組小鼠體質(zhì)量上升趨勢(shì)較大；第28天時(shí)，與模型組比較，各組小鼠體質(zhì)量均呈上升的趨勢(shì)，中藥治療C、E組小鼠體質(zhì)量上升趨勢(shì)較大(P<0.05)。

表1　各組小鼠不同時(shí)期體質(zhì)量±s，g)

注： 與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05;n代表小鼠存活只數(shù)。

2.3　小鼠生存率情況

模型組7天死亡率為40%，各中藥治療組小鼠的7天死亡率較模型組均降低，其中H組死亡率與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組28天死亡率為70%，各中藥治療組小鼠的28天死亡率較模型組均降低，其中C組死亡率與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖1及圖2。

A對(duì)照組　B模型組　C組(大劑量黃芪當(dāng)歸5∶1)　D組(大劑量黃芪當(dāng)歸1∶1)　E組(大劑量黃芪當(dāng)歸1∶5)

圖2　各組小鼠生存曲線

2.4　HE染色觀察

光鏡下觀察，與對(duì)照組比較，模型組小鼠可見支氣管周圍及肺泡間隔有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化程度明顯。中藥C、H組肺泡炎明顯好轉(zhuǎn)，肺泡內(nèi)未見明顯的炎性細(xì)胞，肺泡隔、細(xì)小支氣管周圍的纖維化病灶較模型組有明顯改善，肺泡結(jié)構(gòu)已基本恢復(fù)。中藥D、E、F、G組肺泡炎較對(duì)照組重，但與模型組比較有不同程度地減輕，肺泡隔纖維增生灶較模型組有所改善，但不如C、H組明顯。光鏡觀察HE染色各組炎癥和纖維化程度的結(jié)果見圖3。

A對(duì)照組　B模型組　C組(大劑量黃芪當(dāng)歸5∶1)　D組(大劑量黃芪當(dāng)歸1∶1)　E組(大劑量黃芪當(dāng)歸1∶5)

2.5　膠原染色觀察

油鏡下可見對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，只有肺間質(zhì)及部分支氣管周圍有少量膠原存在。模型組小鼠肺泡壁及肺泡間隔明顯增厚，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡腔基本消失，小支氣管壁可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積。各中藥組膠原含量較模型組均減少，表明這幾組中藥在減輕膠原纖維沉積和抗纖維化方面的都有一定的作用。其中中藥C、H組與模型組比較差異明顯，在減輕膠原纖維沉積和抗纖維化方面效果顯著。光鏡觀察武兆發(fā)簡(jiǎn)化Mallory氏膠原染色纖維化程度的結(jié)果見圖4。

A對(duì)照組　B模型組　C組(大劑量黃芪當(dāng)歸5∶1)　D組(大劑量黃芪當(dāng)歸1∶1)　E組(大劑量黃芪當(dāng)歸1∶5)

2.6　肺組織中c-kit及FGF2、VEGFmRNA的表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組肺組織c-kit、FGF2和VEGF的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均升高(P<0.05)。中藥E、G、H組c-kit mRNA的表達(dá)低于模型組(P<0.05)，C、D、F組高于模型組(P<0.05)。FGF2 mRNA的表達(dá)，中藥D、E、G、H組明顯低于模型組(P<0.05或P<0.01)，C組高于模型組(P<0.05)。中藥E、H組VEGFmRNA表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)，F(xiàn)、G組高于模型組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2　各組c-kit、FGF2、VEGF mRNA含量±s，pg/mL)

注： 與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01;n代表小鼠存活只數(shù)。

3討論

許多研究結(jié)果顯示，急性肺損傷后，異常激活的肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生的介質(zhì)刺激上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞灶的形成，造成疤痕和肺結(jié)構(gòu)的破壞。損傷肺的修復(fù)引起彌漫性肺纖維化。干細(xì)胞作為體內(nèi)未分化細(xì)胞具有很強(qiáng)地自我更新和向其他細(xì)胞分化的能力，在組織的自我修復(fù)中起到非常關(guān)鍵的作用。小鼠模型試驗(yàn)顯示，間質(zhì)干細(xì)胞遷移到肺組織內(nèi)，發(fā)生類上皮樣分化，可減少博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[10]。Wang等[11]研究人胚胎干細(xì)胞分化來(lái)源的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠模型中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可以分化成為肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞，并阻止炎癥反應(yīng)及纖維化反應(yīng)的發(fā)生。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：BASCs在博來(lái)霉素導(dǎo)致的小鼠肺纖維化模型中數(shù)量顯著下降，提示BASCs的數(shù)量和功能可能與肺纖維化的發(fā)生與進(jìn)展相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究顯示：黃芪、當(dāng)歸生藥和其提取物均有一定的抗肺纖維化作用，但黃芪當(dāng)歸對(duì)藥及其提取物對(duì)IPF肺組織干細(xì)胞的干預(yù)作用及對(duì)IPF肺組織局部免疫微環(huán)境影響研究較少。有研究顯示，黃芪及含有黃芪當(dāng)歸的藥物對(duì)c-kit陽(yáng)性細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用，且對(duì)c-kit和干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)蛋白表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用[4-6]，而SCF/c-kit信號(hào)恰恰是BASCs存活的必要條件。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中藥C、D、F組能促進(jìn)c-kit的表達(dá)，提示黃芪當(dāng)歸可能通過(guò)c-kit通路調(diào)節(jié)BASCs的功能，抑制肺纖維化的進(jìn)展。

FGF2能促進(jìn)新生血管形成，啟動(dòng)創(chuàng)傷愈合過(guò)程[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織中FGFR各亞型的表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)而下降，其中FGF2表達(dá)量最高，也成下降趨勢(shì)，鼠齡較大的小鼠其肺組織更多的表現(xiàn)出纖維化改變，這可能與衰老過(guò)程中FGFR的表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)[8]。推測(cè)大劑量黃芪當(dāng)歸5∶1組的治療作用與上調(diào)FGF2基因、促進(jìn)組織修復(fù)有關(guān)。

VEGF是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種特異的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、促進(jìn)血管形成，并具有促進(jìn)血管通透性增加和維持血管正常狀態(tài)和完整性的作用[9]。血管生成是組織損傷后進(jìn)行修復(fù)的必要條件之一，也是肺部纖維化的重要病理改變。研究顯示，在BLM導(dǎo)致的大鼠肺損傷區(qū)域，VEGF免疫反應(yīng)細(xì)胞明顯增加，并隨著肺纖維化發(fā)展過(guò)程中各類細(xì)胞數(shù)量的增加，VEGF表達(dá)量亦增加[14]。 本實(shí)驗(yàn)中藥治療C、D、E、H組均降低了VEGF基因的表達(dá)水平， 其中E組

效果最明顯，提示黃芪當(dāng)歸能夠調(diào)節(jié)損傷的肺臟局部的血管生成，減輕肺纖維化程度。

本研究以經(jīng)典的方法成功制備了IPF小鼠模型，并將不同劑量與配比黃芪當(dāng)歸對(duì)藥應(yīng)用于IPF小鼠。結(jié)果顯示，模型組小鼠體質(zhì)量及生存率明顯降低，HE染色和武兆發(fā)簡(jiǎn)化Mallory氏染色顯示肺組織有明顯的炎癥表現(xiàn)。經(jīng)過(guò)黃芪當(dāng)歸對(duì)藥治療28天后，與模型組比較，各中藥治療組小鼠肺組織炎癥表現(xiàn)明顯緩解，體質(zhì)量及生存率顯著上升，綜合比較，大劑量黃芪當(dāng)歸5∶1組效果顯著，其作用機(jī)制可能與抑制VEGF，促進(jìn)c-kit及FGF2 mRNA的表達(dá)水平有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]Kim CF，Jackson EL，Woolfenden AE，et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer[J]. Cell，2005，121(6)：823-835.

[2]Kim CF. Paving the road for lung stem cell biology：bronchioalveolar stem cells and other putative distal lung stem cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293(5)：1092-1098.

[3]Batmunkh R，Nishioka Y，Aono Y，et al. CCN6 as a profibrotic mediator that stimulates the proliferation of lung fibroblasts via the integrin β1/focal adhesion kinase pathway[J].J Med Invest，2011，58(3-4)：188-196.

[4]張永紅，曾妍，唐曉鵬.黃芪注射液促進(jìn)臍血干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化具有增強(qiáng)移植干細(xì)胞治療大鼠肝衰竭的效果[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(1)：103-107.

[5]沈凌，楊博華，曾績(jī)娟，等.黃芪、三七對(duì)高糖環(huán)境下內(nèi)皮祖細(xì)胞分化的影響[J].北京中醫(yī)藥，2010，29(10)：787-789.

[6]劉靜，羅雪，鐘善傳，等.黃芪皂甙誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(4)：580-583.

[7]Tan EM，Rouda S，Greenbaum SS，et al. Acidic and basic fibroblast growth factorsdown-regulate collagen gene expression in keloid fibroblasts[J].Am J Pathol，1993，(142)：463-470.

[8]李小溪，常紅恩，奈文青，等.成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體各亞型與小鼠肺纖維化及衰老的關(guān)系[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33(4)：607-610.

[9]PotgensAJ ，Westphal HR ，Waal RM，et al. The role of vas-cular permeability fator and basic fibroblast growth factor intumor angiogenesis[J]. BiolChem Hoppe-Seyler，1995，376(2)：57-70.

[10]King TE Jr，Pardo A，Selman M. Idiopathic pulmonaryfibrosis[J]. Lancet，2011，378(9807)：1949-1961.

[11]Wang D，John EM，Daniel GC，et al. Transplantation ofhuman embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type IIcells abrogates acute lung injury in mice[J]. Mol Ther，2010，18(3)：625-634.

(本文編輯： 董歷華)

作者單位： 100029北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院[李麗君(碩士研究生)、范盎然、葛東宇、吳謙(碩士研究生)、王淑艷、李根茂、陳萌、李麗娜]

Influence of the pair drugs of astragalus and angelica on the IPF living conditions and tissue repair related gene expression level in miceLILi-jun，F(xiàn)ANAng-ran，GEDong-yu，etal.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor：LIWei-hua，E-mail：liweihua@medmail.com

【Abstract】ObjectiveTo observe the influence of different doses and compatibility proportion of the pair drugs of astragalus and angelica on the survival rate，weight and tissue repair kit and FGF2 c - related genes，level of VEGF expression of IPF mice and discuss the relationship between the pair drugs and the protection mechanism. Methods80 SPF ICR male mice were randomly divided into the normal control group，the model group，the traditional Chinese medicine treatment group and 6 (Three groups of large dose of astragalus membranaceus and angelica: 1.50 g and 10 g; 2.30 g and 30 g; 3.10 g and 50 g. Three groups of small doses of Astragalus and Angelica: 4.25 g and 5 g; 5.15 g and 15 g; 6.5 g and 25 g). Except the normal control group，other groups by intratracheal injection of bleomycin (5mg/kg) to replicate the model of pulmonary fibrosis in mice，the mice were sacrificed after 28 days. The expression levels of the repair of FGF2 and VEGF related gene c-kit were tested by RT-PCR; the morphological changes of lung tissue were observed by HE staining and Wu Zhaofa simplified Mallory’s staining. ResultsThe result of HE dyeing and reduction Wu Zhaofa Mallory showed that six Chinese medicine treatment groups were improved compared to the model group and the Chinese medicine group of 1 and 6 showed significant improvement, and the alveolar structure have been restored. Compared to the model group, mice weight of each group showed ascendant trend, and Chinese medicine group of 1 showed significantly larger trend of weight gain in mice (P<0.05). Mice mortality was reduced in the Chinese medicine treatment groups compared to the model group, and the group 1 showed significant difference(P<0.05). Expression levels of c-kit，F(xiàn)GF2，VEGF mRNA in the model group were significantly higher than the control group(P<0.05). ConclusionThe results showed that the large dose of astragalus and angelica group of 5∶1 can obviously improve the quality of the survival of mice and its mechanism may be related to inhibit the expression of VEGF mRNA level, and promote the c-kit and FGF2 mRNA expression level.

【Key Words】Pulmonary fibrosis；Astragalus membranaceus；Angelica；Fibroblast growth factor 2；Vascular endothelial growth factor

(收稿日期：2015-03-24)

通訊作者：李麗娜(1973- )，女，博士，副教授，副主任醫(yī)師。研究方向：經(jīng)方治療疑難病的分子機(jī)制。E-mail：lilina1024@126.com

作者簡(jiǎn)介：李麗君(1987- )，女，2012級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：經(jīng)方治療疑難病的分子機(jī)制。E-mail：798985179@qq.com

基金項(xiàng)目：北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題(2013-SYJS-113)

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2015.12.005