大鼠坐骨神經損傷后嘌呤P2Y4受體表達變化的實驗探究

何旭峰 肖昌松 肖俊霞

大鼠坐骨神經損傷后嘌呤P2Y4受體表達變化的實驗探究

何旭峰 肖昌松 肖俊霞

目的 探討大鼠坐骨神經受損是否會影響嘌呤P2Y4受體表現，對三磷酸腺苷/三磷酸鳥苷(ATP/UTP)對周圍受損神經起到的積極作用進行研究。方法 取36只SD大鼠作為研究對象，將36只大鼠隨機均分為正常組、對照組以及觀察組。對觀察組大鼠行一側坐骨神經切斷修復模型，分別在術后1d、1、2、3、4周后處死大鼠，取出部分坐骨神經，脊髓以及神經節。對照組大鼠僅做切口，不進行其他手術；正常組為正常參照對象，同時檢測RT-PCR（半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應）產物的序列。結果 正常組大鼠與對照組大鼠脊髓與坐骨神經均發現P2Y4mRNA表達［正常組脊髓：（0.215±0.032），坐骨神經：（0.643±0.011）；對照組脊髓：（0.221±0.027），坐骨神經：（0.653±0.012）］；2組對比差異無統計學意義。觀察組大鼠坐骨神經切斷后，吻合口遠端P2Y4mRNA表達呈逐漸變強現象。結論 觀察組大鼠坐骨神經切斷后，吻合口遠端P2Y4mRNA表達呈逐漸變強現象，近端呈逐漸減弱現象。

坐骨神經；P2Y4mRNA；背根神經節

細胞外三磷酸腺苷/三磷酸鳥苷(ATP/UTP)的主要作用為神經遞質或神經調質。據了解，ATP/UTP經受體能直接作用于神經系統，有助于促進膠質細胞、軸突組織修復或再生，因此臨床多被用來治療腦外傷或腦缺血性損傷[1]。在周圍神經系統中，坐骨神經受損后，細胞外ATP參與促進軸突再生，神經修復等活動。不過現階段，該作用機制暫時尚不明確[2]。為了進一步研究該作用的機制，進行了此研究，取得了較明確的研究結果，現報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 取36只SD清潔級雄性大鼠[SCXK (浙)2012-0033]作為研究對象，36只SD大鼠鼠齡2～3個月，體質量120～180g。將36只大鼠隨機均分為正常組、對照組與觀察組[3]，每組12只。

1．1．2 試劑與儀器

1．2 方法

1．2．1 動物模型制作 正常組大鼠為正常參照組，對照組大鼠僅做切口不進行其他手術。使用1%異戊巴比妥鈉對觀察組大鼠進行腹腔麻醉，切開大鼠左側臂肌，充分暴露手術視野，于梨狀肌下端尋找到坐骨神經，切斷后利用無創縫線縫合切口處外膜，利用縫線于手術切口兩側做標記[4]。對觀察組大鼠行一側坐骨神經切斷修復模型，分別于術后1d、1、2、3、4周后處死大鼠，取出部分坐骨神經，脊髓以及神經節。

1．2．2 標本收集 所有大鼠均采用1%異戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，切開大鼠左側臂肌，充分暴露手術視野，于梨狀肌下端尋找到坐骨神經，切斷取出留以備用。并于大鼠背側行縱切口，借助顯微鏡，采集部分脊髓與左側背根神經節。取出后剝離外膜，反復沖洗取出物，與坐骨神經標本一起封存于液氮中，方便實驗取用。

1．2．3 RT-PCR（半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應） 取備用組織 3mg，研碎后提取 RNA。利用紫外分光光度計測量RNA的濃度，加入AMV逆轉錄酶充分反應，合成cDNA的第一鏈。根據參考文獻配置PCR引物，上游5c-T GGGTGTTTGGT TGGTAGTA-3，下游5c-GT CCCCCGTGAAGAGAT AG- 3c。將BActin設置為內參對照：上游5c-CCT TCCT GGGCAT GGAGTCCTG-3c，下游5c-GGAGCAATGATCTT GATCTT C-3c[5]。為確保內參數與目的基因存在可比性，可對PCR行擴增處理，使反應進入到平臺期以前，于指數增長期就結束。

1．2．4 檢測操作 使用瓊脂糖凝膠電泳測量PCR水平，利用UVPgrab-it做成像處理，呈像結果經Gelworks ID Advanced V4 01 圖像分析軟件進行處理。取100μL物電泳后純化，于ABI PRISM 自動測序儀內，檢測序列。

1．3 統計學方法 所有的數據都經過SPSS14．0/PC+軟件包加工處理，計量資料采用“x±s”表示，使用t檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 正常組與對照組大鼠檢測結果 檢測結果顯示，2組大鼠脊背與坐骨神經均檢測到在P2Y4嘌呤受體，且顯示有規律性，2組大鼠脊神經節均不存在有規律片段［正常組脊髓：（0．215±0．032），坐骨神經：（0．643±0．011）；對照組脊髓：（0．221±0．027），坐骨神經：（0．653±0．012）］，2組對比差異無統計學意義。

2．2 P2Y4mRNA 表達的規律 PCR經逆轉錄處理后，取出464bp的片段；B-Actin獲得205bp片段。這些片段均能在正常組大鼠的脊髓（0．217±0．023）、神經近端（0．655±0．022）與遠端（0．656±0．011）中檢測到。觀察組大鼠坐骨神經切斷后，吻合口遠端P2Y4mRNA表達呈逐漸變強現象［脊髓：1周（0．431±0．022），2周（0．521±0．014）；神經近端：1周（0．499±0．014），2周（0．382±0．047）；神經近端1周（0．825±0．054），2周（0．918±0．015）］。

3 討論

Aonok等在1990年發現ATP等和其代謝產物，可通過受體提高細胞內游離鈣離子的濃度對PC12細胞發揮保護作用[6]，嘌呤能受體由Burnstock于1978年被正式命名[6]，根據組織反應類型與催化劑功能強度，發現P2嘌呤受體可被歸為P2X和P2Y2大類型。P1型受體主要介導nine和AMP的作用，P2受體主要介導P2X和P2Y2大類型。P2X受體主要分布在中樞神經系統、平滑肌細胞、支氣管上皮等，P2Y受體主要集中在中樞神經系統、血管內皮細胞等部位，用于參與細胞增殖與分化活動。坐骨神經中，主要存在P2Y2、P2Y4和P2Y6這三大類P2Y亞型受體。通過多年研究經驗不難發現，鼠類P2Y4受體和人類的P2Y4受體基因序列吻合度高達84%，且絕大多數序列都處于跨膜去與胞外環，具有參考價值。P2Y4受體主要分布于大鼠腦組織與脊髓內，能促進中樞受損細胞再生與修復。P2Y4受體在肝內膽管、膽囊上皮及空腸上皮，促進氯離子的分泌。本研究結果顯示，P2Y4受體可在脊髓灰之中表達，表達主要集中在前交運動神經元與中央管上皮細胞，且于白質中呈陰性，且脊髓、背根神經節及坐骨神經有恒定表達[7]，這一實驗結果與本研究預測實驗記過基本相符。經序列測定，結果顯示與現有文獻研究結論完全吻合[8]。該實驗結果提示，正常SD大鼠脊髓與坐骨神經中，均能檢測到受體表達，而脊神經節中未發現受體表達。由此推斷，僅做切口不行手術，不會影響P2Y4mRNA的表達。脊髓內表達在2周內達到最活躍狀態，4周后逐步接近正常值[9]。這主要是由于骨神經損傷的保護性作用，參與了維持脊椎神經元的存活，從而有利于周圍神經的再生。

RT-PRC是一種靈活度很高的實驗技術，為了達到保證內參和目的基因的可比性，實驗對PRC進行擴增。經過長時間的觀察，推測ATP/UTP通過P2Y4受體參與了周圍神經損傷后的病例調理與改變，在神經修復中起重要作用。

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[2] 呂蘭，張長杰，黃德清．脈沖電磁場對大鼠坐骨神經損傷的作用研究[J]．福建醫藥雜志，2012，34（3）：67-70．

[3] 王曉亮，楊朝陽，李曉光，等．應用人工神經修復大鼠坐骨神經損傷的實驗研究[J]．中國康復理論與實踐，2012，18（6）：535-538．

[4] 高玉峰，姚斌彬，吳劍聰，等．推拿對大鼠坐骨神經損傷后MAP-2和NF-M表達的影響[J]．中醫藥導報，2014（1）：11-13．

[5] 王卒平，劉啟蒙，況勇，等．人神經營養素4治療大鼠坐骨神經損傷效果觀察[J]．中國現代醫學雜志，2012，22（4）：20-23．

[6] Aonok,Nakanishi N,Yamada S,et al．Increase in intr acellula r Ca2+ level and modulation of nerveg rowth facto raction on pheochromo cytoma PC12 cells by extr acellular ATP[J]．Meikai Daigaku shigaku zasshi,1990,19(2)：221-229．

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[8] 劉強，王德國，梁茂華，等．曲安奈德對SD大鼠坐骨神經損傷后功能恢復影響的實驗研究[J]．中國矯形外科雜志，2012，20（6）：556-558．[9] 陳宣煌，鄭祖高，占鯉生，等．膽囊收縮素對大鼠坐骨神經損傷后修復的影響[J]．南昌大學學報：醫學版，2012,52（7）：4-7．

10．3969/j．issn．1009-4393．2015．18．008

湖南 421002 衡陽核工業衛生學校 （何旭峰 肖昌松 肖俊霞）