姜黃素對人結腸癌Lovo細胞VEGF表達的影響

袁琦++++++張征++++++胡小宣

[摘要] 目的 研究姜黃素體外對人結腸癌Lovo細胞血管內皮生長因子VEGF表達的影響。方法 不同濃度（0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）姜黃素處理2013年8月—2014年2月中南大學提供的人結腸癌細胞株Lovo24 h后，用Real-time PCR檢測姜黃素對人結腸癌細胞株血管內皮生長因子VEGF mRNA表達的變化，用Western blot法檢測姜黃素對人結腸癌細胞株VEGF蛋白表達的變化。 結果 人結腸癌Lovo細胞經過姜黃素處理24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L姜黃素組VEGF mRNA及蛋白的表達均明顯下降，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。結論 姜黃素能下調人結腸癌Lovo細胞VEGF的表達，并呈劑量依賴，這可能是姜黃素抑制結腸癌Lovo細胞增殖及侵襲性的機制之一。

[關鍵詞] 姜黃素；結腸癌；血管內皮生長因子

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）12（b）-0035-03

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術、郁金等的根莖中提取的一種天然有效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理作用，且毒性低，具有良好的臨床應用潛力，尤其是其抗腫瘤作用受到國內外廣泛關注。結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，雖然近年來以手術、化療、放療、免疫等的綜合治療手段取得了一定的進展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制著化療藥物和免疫制劑等的應用和療效。有研究表明，姜黃素能顯著抑制結腸癌HCT-116細胞的生長[1]，姜黃素能顯著抑制人結腸癌Lovo細胞的增殖并促進其凋亡[2]，研究證實在腫瘤的侵襲、轉移過程中，血管內皮生長因子（VEGF）起到了極其重要的作用[3]。該實驗以2013年8月—2014年2月中南大學提供的結腸癌Lovo細胞作為研究對象，觀察了不同濃度姜黃素對結腸癌Lovo細胞VEGF表達的影響，以求從多角度對姜黃素對結腸癌細胞的作用進行研究，對結腸癌臨床治療提供有益的理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人結腸癌Lovo細胞由中南大學腫瘤研究所提供；姜黃素購自Sigma公司，稱取3.684 mg的原料藥充分溶解于1 mL DMSO中，得到終濃度為10 mmol/L的母液，臨用時用完全細胞培養液稀釋到所需濃度。 Trizol、逆轉錄試劑盒購自大連寶生物公司， 引物由大連寶生物公司合成。蛋白提取液及ECL發光試劑盒購自Pierce公司， 兔抗人VEGF多克隆抗體及羊抗兔二抗lgG購自Santa Cruz公司。

1.2 細胞的培養及處理

人結腸癌Lovo細胞接種于含10%胎牛血清1640培養基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，隔天換液，待細胞長至對數生長期時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的Lovo細胞，實驗分組為對照組（姜黃素0 μmol/L，加入等量DMSO），姜黃素5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L組，處理后再置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養24 h。

1.3 Real-time PCR

采用Trizo1試劑一步法提取細胞總RNA ，紫外分光光度計測定總RNA濃度，計算OD260/ 280，比值在1.8～2.0的RNA標本用于反轉錄。總RNA按說明書進行逆轉錄反應合成cDNA， 逆轉錄產物cDNA用于Real-time-PCR擴增。VEGF引物：5'端：5'-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3'及3'端：5'-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3'，變性、退火溫度為94℃與72℃，40個循環。利用標準曲線，根據樣品CT值計算出樣品中所含的模板量。

1.4 Western Blot

用蛋白提取液提取細胞蛋白， BCA測總蛋白質濃度。蛋白樣品用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，上樣量為20 μg。5%脫脂奶粉TBS緩沖液封閉，4℃過夜，加兔抗人VEGF多克隆抗體（ 1：500）室溫2 h， 洗膜30 min， 加入羊抗兔二抗（ 1：1000）室溫結合1 h， ECL顯色， 內參采用β-actin。采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對蛋白條帶進行灰度分析。以VEGF條帶與內參β-actin條帶的灰度比值代表VEGF蛋白的表達水平。

1.5 統計方法

實驗所得計量數據以（x±s）表示， 采用SPSS13.0軟件進行方差分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同劑量姜黃素對人結腸癌Lovo細胞VEGF mRNA表達的影響

利用Primer 3.0軟件分別設計出擴增人VEGF和GAPDH mRNA的引物， Real-time PCR檢測VEGF mRNA的表達，見表1，并用EXCEL做出各組VEGF mRNA相對表達量柱狀圖表達，見圖1，姜黃素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組與對照組相比，VEGF mRNA的表達均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），且呈劑量依賴性。

表1 姜黃素處理后，Lovo細胞VEGF mRNA和蛋白的相對表達（x±s）

2.2 不同劑量姜黃素對人結腸癌Lovo細胞VEGF蛋白表達的影響

不同劑量姜黃素處理Lovo細胞，收集細胞總蛋白，用Western Blot檢測VEGF蛋白的表達（結果見圖2），并用Image-Pro Plus6.0對圖像進行灰度分析（結果見表1，圖3），姜黃素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組與對照組相比VEGF蛋白表達均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），且呈劑量依賴性。endprint

3 討論

血管內皮生長因子VEGF隨著腫瘤增殖、侵襲和轉移而表達明顯升高[4]。VEGF信號還與腫瘤細胞的淋巴管、淋巴結侵襲及遠端轉移密切相關[5]。梁啟廉等研究發現VEGF表達水平與大腸癌組織學分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移有關[6]。且臨床觀察發現大腸癌患者術前血清VEGF水平與大腸癌的浸潤、轉移密切相關[7]。有研究者利用同源重組將結腸腸癌細胞系中VEGF-A敲除后發現，當細胞缺失了VEGF信號后，細胞的生長受到了明顯的抑制，且細胞對化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性增強[8]，而在臨床上僅僅通過阻斷細胞表面的VEGF受體來治療結直腸癌效果是有限的。

目前研究發現，姜黃素能夠對消化系腫瘤有很好的抑制作用，其藥理活性主要表現在能夠下調核轉錄因子（NF-k B）的活性，誘導細胞周期停滯和細胞凋亡，抑制血管生成[9]。在人結腸癌HCT116細胞中，姜黃素可有效抑制結腸腺癌細胞集落生長和侵襲能力[10]。不同濃度姜黃素作用人結腸癌SW620細胞24 h，增殖抑制顯著[11]。

該研究用4種不同濃度的姜黃素分別作用Lovo細胞24 h后，利用Real-time PCR及Western Blot方法檢測VEGF的mRNA及蛋白的表達，發現各姜黃素組（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）與對照組比較，VEGF的mRNA及蛋白的表達明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），且姜黃素的作用濃度越高，VEGF的表達量越低，該作用呈劑量依賴，提示姜黃素能通過抑制人結腸癌細胞Lovo中VEGF的表達來抗結腸癌血管形成，抑制結腸癌細胞的生長和轉移。此結果與賈佳等的觀點一致，他們發現姜黃素能夠下調結腸癌細胞HT-29中β-catenin、VEGF的表達[12]。在多個結腸癌細胞系中，均有研究證實姜黃素能下調VEGF的表達，進一步可利用建立的結腸癌裸鼠移植瘤模型，從體內水平研究姜黃素能否下調瘤組織VEGF的表達，且姜黃素是否通過NF-KB信通路來下調人結腸癌細胞VEGF的表達，該機制也有待進一步研究。VEGF是抗癌藥物治療的新靶點，姜黃素作用后的人結腸癌Lovo細胞VEGF水平下降，提示姜黃素可能通過下調VEGF的表達抑制了VEGF促進腫瘤新生血管的作用，從而抑制了結腸癌的增殖和轉移。該研究為姜黃素的臨床應用提供新的理論依據。

[參考文獻]

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[5] 劉桂君，陳國江，黎燕，等.血管內皮生長因子在腫瘤生長轉移中的作用機制研究進展[J].國際藥學研究雜志，2012，39（5）：391-395.

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[7] 李德川，馮海洋，徐笑紅.大腸癌患者血清VEGF水平的臨床研究[J]. 癌癥，2001，20（3）：314-316.

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[9] 趙鵬，蔡輝.姜黃素藥理作用研究進展[J].中醫藥臨床雜志，2012，24（4）：380-382.

[10] 范鈺， 張尤歷， 許則豐. 姜黃素抑制結腸癌SW620細胞侵襲的體外實驗研究[J].江蘇大學學報：醫學版，2006，24（4）：298-300.

[11] 羅強， 孫黎， 張力，等. 姜黃素對人結腸癌SW620細胞凋亡機制的影響[J].中國老年學雜志，2011，24（16）： 3108-3109.

[12] 賈佳，趙逵，張銀萍，等.姜黃素對人結腸癌細胞HT-29中β-catenin、血管內皮生長因子的影響[J].中國老年學雜志，2014，24（14）：3940-3942.

（收稿日期：2014-09-16）endprint