牦牛AQP9基因CDS全長序列克隆及其生物信息學特征分析

劉健鋒，丁艷平，伍志偉，王建林，邵寶平*

(1.蘭州大學生命科學學院，動物學與發育生物學研究所，蘭州 730000；2.西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070；3.甘肅中醫學院 系統生物學與中醫藥轉化研究所，蘭州 730020)

牦牛AQP9基因CDS全長序列克隆及其生物信息學特征分析

劉健鋒1，丁艷平2，伍志偉3，王建林1，邵寶平1*

(1.蘭州大學生命科學學院，動物學與發育生物學研究所，蘭州 730000；2.西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070；3.甘肅中醫學院 系統生物學與中醫藥轉化研究所，蘭州 730020)

為了研究高原動物對青藏高原極端生境的適應機理，并為探討高原動物適應機制提供基本數據。本研究運用基因克隆技術對牦牛腦AQP9基因CDS全長序列進行克隆，采用生物信息學方法進行分析，AQP9基因和編碼序列特征進行了以下幾方面的預測和分析：其物化性質、疏水性、跨膜結構和蛋白二級結構。結果表明，牦牛AQP9的CDS含有一個885 bp的開放閱讀框，編碼295個氨基酸；牦牛AQP9基因編碼蛋白分子量和理論等電點分別為31.89 ku和6.21，其編碼蛋白含有6次跨膜結構，屬于疏水性蛋白；二級結構由α-螺旋、延伸鏈、β-折疊及無規則卷曲構成；牦牛AQP9基因編碼氨基酸序列與黃牛、藏羚羊、綿羊等物種間同源性較高，系統進化情況與其親緣關系遠近一致。本研究將為牦牛低氧適應性研究提供一定的基礎資料。

牦牛；AQP9基因；CDS區；分子克隆；生物信息學

AQP9(水通道蛋白9，AQP9)是水通道蛋白家族第二亞類水甘油通道蛋白(包括AQP3、AQP7、AQP9和AQP10)的成員之一[1]。1997年，H.Kuriyama等[2]在進行人類脂肪組織基因序列系統分析過程中首次發現AQP9。近年的研究表明，AQP9可以透過嘌呤(腺嘌呤)、嘧啶(尿嘧啶和化學療法中使用的氟尿嘧啶)及一元羧酸(乳酸和β-羥基丁酸)[3-4]；AQP9對一元羧酸，比如乳酸和β-羥基丁酸的通透效率與體內pH相關，尤其在pH為5.5時通透性急劇增加[3]；AQP9還可以促進砷類金屬的運輸，這表明AQP9可能是哺乳動物細胞攝取亞砷酸鹽的主要途徑[5]。AQP9主要分布于星形膠質細胞和兒茶酚胺能神經元細胞膜上[6]，而兒茶酚胺神經元的電位活動在甘油和乳酸濃度上升時會被改變，包括攝食行為的最終改變。綜上所述，除水分子外，AQP9對尿素、甘油、多元醇、乳酸等多種小分子溶質均有通透性，可參與組織中水的轉運、水電解質的平衡調節、滲透壓的感知及能量代謝等[6-11]。

缺氧是引發眾多類型腦疾病，尤其是腦水腫發生、發展的重要因子。腦是機體適應其棲息地進行生存、生產及繁衍的“指令中樞”，又是對環境氧最敏感的器官。腦神經細胞作為進化最古老的細胞，“水和能量的代謝”在維持其正常生理功能中發揮了非常重要的生理作用。大量研究表明低氧可上調AQP9蛋白的表達且AQP9的表達與腦水腫程度呈正相關[1，7，10，12-13]。牦牛作為體型最大、運動劇烈且好動的半野生動物，其對高寒、低氧極端生境的適應早已引起國內外廣大學者的關注[14-15]。但是，到目前為止，在國內外還尚未見到有關“牦牛腦AQP9基因CDS全長序列及其相關生物信息學特征”的研究報道。本研究運用基因克隆、表達質粒構建及生物信息學分析等技術和方法，對牦牛AQP9基因進行了CDS全長序列克隆及生物信息學特征分析。本研究結果將為明晰高原動物對青藏高原高寒、低氧等極端環境的適應機理，進一步探討高原動物腦神經細胞在其極端生境中水和能量代謝的分子機理，以及為人類高原疾病的預防和治療研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物為健康成年甘南牦牛(3～4歲，體重約225 kg，海拔>3 400 m)。試驗材料采于甘肅省甘南州瑪曲縣屠宰場，在動物屠宰后，立即取其頭沿矢狀面開顱取腦，用無菌生理鹽水將腦快速沖洗干凈后剪成小塊迅速放入液氮中帶回實驗室，-80 ℃超低溫冰箱長期保存。

1.2 分子生物學試劑

Trizol試劑、TaKaRa反轉錄試劑盒、TaKaRa PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、DL5000 DNA marker、DL2000 DNA marker、E.coliDH5ɑ、DNA凝膠回收試劑盒、限制性內切酶EcoR I和KpnI及質粒提取試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Kan抗生素、DNase I和DEPC購自Sigma公司(美國)，pEGFP-C1載體和感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛大腦皮質總RNA的提取 采用Trizol法提取大腦皮質總RNA，DNase I去除基因組中殘留的DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測總RNA的質量，-70℃保存備用。

1.3.2 引物設計與合成 參考GenBank中黃牛AQP9基因cDNA序列設計特異性引物P1和P2，即P1：5′-GGAATTCATGCAGCCTGAGATGGA-ACAAA-3′；P2：5′-GGGGTACCTTACATGATT-GCATTCAGTTCATATTT-3′，橫線部分分別為EcoR I和KpnI內切酶酶切位點序列。擴增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3.3 RT-PCR擴增 以牦牛大腦皮質總RNA為模板進行逆轉錄反應，總反應體系10 μL：5×PrimeScript Buffer 2 μL，RNase free dH2O 7 μL，500 ng·μL-1總RNA 1 μL，混勻后，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s條件下進行逆轉錄反應，將產物4 ℃保存。以逆轉錄產物為模版，P1、P2為引物，擴增AQP9基因。PCR反應體系25 μL：5×Prime Star Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，上下游引物各0.5 μL，TaKaRa PrimeSTAR HS 0.25 μL，cDNA模板1 μL，RNase-Free dH2O 15.75 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用l%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后，用DNA片段回收試劑盒對PCR產物回收。

1.3.4AQP9基因的克隆 回收的PCR產物在T4 連接酶的作用下與pEGFP-C1載體進行過夜連接12～16 h。將連接產物轉化至感受態E.coliDH5ɑ中，37 ℃，100 r·min-1培養1 h，涂于含有Kan的LB固體培養基上，37 ℃培養12 h。挑取陽性單克隆接種于含有Kan的LB液體培養基中，37 ℃，180 r·min-1過夜培養。用“質粒提取試劑盒”提取質粒后用EcoR I和KpnI內切酶進行雙酶切鑒定。鑒定成功后將質粒送往上海生工公司進行測序。1.3.5 生物信息學分析AQP9基因開放閱讀框(ORF)采用NCBI的ORF Finder程序分析，序列比對及同源性分析使用DNAMAN軟件及在線NCBI網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)；蛋白質特性預測使用Bioedit及Lasergene7.1軟件包中的Protean軟件；親水性疏水性預測采用Epasy服務器上的protscale程序(http：//web.expasy.org/protscale/)；蛋白質二級結構預測采用法國里昂CNRS的SOPMA軟件(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)，并利用SWISS-MODEL軟件(http：//swiss-model.expasy.org/)進行三級結構預測；使用MEGA 4.0軟件構建系統進化樹，置信度用Boot-strap檢驗(重復次數為1 000)。

2 結 果

2.1 牦牛AQP9基因的PCR擴增

牦牛大腦皮層總RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測到28S、18S和5S 3條帶(圖略)，OD260 nm/OD280 nm平均為1.95，表明RNA完整性較好，沒有蛋白質或DNA污染，且純度和濃度適合RT-PCR。經特異性引物PCR擴增的產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示，DNA片段在1 000 bp左右，可能還含有編碼區兩側序列，與預期DNA片段(885 bp)大小并不矛盾，條帶清晰且特異性良好，可以進行切膠回收進一步做克隆。

M.DNA相對分子質量標準；1～3. PCR擴增產物M.DNA marker;1-3. PCR products圖1 AQP9基因PCR擴增產物的電泳圖Fig.1 The PCR amplification of AQP9 gene

2.2 牦牛AQP9基因克隆及重組子的鑒定

提取菌液的質粒并用EcoR I和KpnI內切酶雙酶切鑒定重組質粒，得到一條約5 000 bp的pEGFP-C1線性片段和約900 bp的插入片段(圖2)，與預期相符。

M.DNA相對分子質量標準；1.重組質粒的雙酶切片段M.DNA marker;1.Recombinant plasmid digested by double digestion圖2 重組質粒的雙酶切鑒定Fig.2 Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid

2.3 牦牛AQP9基因的序列測定及分析

將雙酶切鑒定正確的陽性重組質粒送往上海生工公司測序。測序結果表明，克隆得到的序列在NCBI上進行同源性搜索，所得到的目的基因為牦牛AQP9編碼區全長(CDS)，為885 bp，編碼295個氨基酸，其中3個半胱氨酸(Cys)。應用NCBI的ORF Finder程序對牦牛AQP9基因序列開放閱讀框分析，分析表明AQP9基因含有一個長度為885 bp的開放閱讀框，編碼295個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA(圖3)。

2.4 牦牛AQP9蛋白的生物信息學分析

2.4.1 牦牛AQP9蛋白的理化性質 運用Protparam軟件分析了牦牛AQP9蛋白的基本理化性質，其分析表明：蛋白分子量為31 892.4 u，理論等電點為6.21；含有20種基本氨基酸，其中含量最高的是Ala(11.5%)，含量最低的是Cys(1.0%)；有帶負電荷的殘基23個，帶正電荷的殘基20個；280 nm的摩爾消光系數為34 045 mol·cm-1；蛋白的平均親水系數為0.569。2.4.2 牦牛AQP9蛋白的親水性/疏水性 運用Expasy服務器中ProtScale程序對牦牛AQP9的親水性/疏水性進行了分析，如圖4所示，第160位異亮氨酸(Ile)疏水性最強(最高分值3.800)；第271位組氨酸(His)親水性最強(最低分值為-3.2)。

圖3 牦牛AQP9基因的堿基和氨基酸序列Fig.3 The nucleotide and amino acid sequences of yak AQP9 gene

圖4 牦牛AQP9蛋白疏水性分析Fig.4 Analysis of hydrophobicity of yak AQP9 protein

2.4.3 牦牛AQP9蛋白的跨膜區分析 運用TMHMM server 2.0分析表明，如圖5所示，該蛋白為6次跨膜蛋白，即1～26位氨基酸為胞內部分；27～49氨基酸為第1個跨膜螺旋；50～58氨基酸在胞外；59～81氨基酸為第2個跨膜螺旋；82～101為胞內部分；102～124為第3個跨膜螺旋；125～157為胞外部分；158～180為第4個跨膜螺旋；181～192為胞內部分；193～215為第5個跨膜螺旋；216～242為胞外部分；243～265為第6個跨膜螺旋；266～295為胞內部分。

圖5 牦牛AQP9蛋白跨膜區域Fig.5 Transmembrane region of yak AQP9 protein

2.4.4 牦牛AQP9蛋白的高級結構預測 如圖6所示，運用SOPMA服務器分析表明，牦牛AQP9的二級結構由α-螺旋、延伸、β-折疊及無規則卷曲4種結構組成，其各種結構所占比例分別是38.18%、24.32%、4.73%及32.77%，其中α-螺旋主要分布在位于細胞內的氨基酸兩端。運用SWISS-MODEL進行同源建模，如圖7所示，牦牛AQP9蛋白的三級結構也是由α-螺旋、延伸、β-折疊和無規則卷曲構成，這與二級結構預測結果一致。

圖6 牦牛AQP9蛋白二級結構Fig.6 Secondary structure of yak AQP9 protein

2.4.5 牦牛AQP9蛋白同源性及系統發育分析 通過NCBI數據庫中收集下載7個物種的AQP9基因編碼蛋白序列，采用MegAlign軟件進行同源性分析，發現牦牛AQP9基因編碼蛋白與其他物種AQP9基因編碼蛋白具有較高的同源性，牦牛AQP9氨基酸序列與黃牛、藏羚羊、綿羊、野豬、野駱駝、人、及狼的同源性分別為99.8%、97.1%、96.7%、89.6%、88.2%、87.6%及87.5%。用NJ法構建了上述8個物種AQP9的基因系統發育樹，如圖8所示，牦牛與黃牛、藏羚羊及綿羊在系統發育樹中距離最近。

3 討 論

隨著人類基因組測序工作的基本完成，基因組學的研究從結構基因組學過渡到了功能基因組學[16]。cDNA的測序已成為人們了解編碼基因結構與功能的關鍵所在。生物信息技術為試驗研究提供了重要的線索，對隨后的研究起到了“事半功倍”的作用。隨著基因組序列信息的日益豐富，計算方法和數據庫的不斷完善，生物信息學將在基因全長cDNA克隆和分析中扮演更加重要的角色。1988年，B.M.Denker首先從哺乳動物的紅細胞膜上發現了一個28 ku的疏水性跨膜蛋白[17]。1991年G.M.Preston等[18]完成了第一個水通道蛋白cDNA的分子克隆和功能鑒定，證明了哺乳動物的細胞膜上有可以特異性轉運水的結構，從而促進了一個新的研究領域的發展。迄今為止，在哺乳動物組織中已發現13種AQP (AQP0-AQP12)。AQPs的發現對生物有機體內物質跨膜轉運和細胞內外環境平衡調節機制的研究及臨床代謝類障礙疾病病理的發現、認識和治療，具有劃時代的意義。

圖7 牦牛AQP9蛋白三級結構Fig.7 Putative tertiary structure of yak AQP9 protein

圖8 NJ法構建的AQP9基因系統發生樹Fig.8 Phylogenetic tree of AQP9 gene by NJ method

表1 牦牛與其他7個物種AQP9的氨基酸序列同源性比較

本研究克隆得到的牦牛AQP9基因編碼區序列具有特定的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)，是牦牛AQP9基因編碼區全長序列，編碼AQP9蛋白。牦牛AQP9基因含有一個長度為885 bp的開放閱讀框，編碼295個氨基酸。通過對牦牛AQP9基因編碼氨基酸序列跨膜結構進行分析表明，肽鏈中含有6個串聯的疏水跨膜區，且這些跨膜區富含α-螺旋，缺少β-折疊結構，這與水通道蛋白家族其他成員結構相似[19]。該蛋白具有水通道蛋白家族保守的序列特征，其二級結構由α-螺旋、延伸、β-折疊以及無規則卷曲4種結構模式組成，且α-螺旋和無規則卷曲分別占33.18%和24.32%，這與其他AQPs結構相似[19]。牦牛AQP9基因編碼氨基酸序列中含有兩個天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)結構，NPA為AQP家族共有的特征結構，這與G.M.Preston等[18]發現的結果相一致，且這兩個NPA序列在空間上圍繞通道中軸呈點對稱分布。依據氨基酸分值越低親水性越強和分值越高疏水性越強的規律可知，AQP9蛋白整體疏水性較強，僅兩端膜內的部分氨基酸具有較好的親水性。同源建模結果表明，牦牛AQP9蛋白的高級結構是由相同的4個亞基組成的同源四聚體，這與鼠的高級結構類似[20]。

序列同源性在一定程度上反映物種間親緣關系的遠近。通過序列比對和系統進化分析發現，牦牛AQP9蛋白與其他物種AQP9蛋白具有較高的同源性，這與物種進化的結果相一致，表明AQP9基因可能是由同一個祖先基因進化而來，同時也反映了AQP9蛋白在不同物種結構上的穩定性對生物體功能的重要性。盡管牦牛和黃牛AQP9蛋白氨基酸序列間同源性很高，但還是存在兩個氨基酸的差異。另外，大量研究表明，在腦神經細胞中AQP9蛋白同時參與水和能量代謝最重要的膜通道蛋白[1，7，10，12-13]；而且，AQP9蛋白還在腦水腫的發生、發展及其清除過程中也發揮著重要作用[13，21-22]。由此推測，在青藏高原極端低氧環境中，AQP9蛋白在牦牛腦神經細胞的水和能量代謝及其高原腦水腫抗性的調控中發揮中非常重要的作用，但其具體調控機理有待進一步研究。

本研究利用分子克隆手段獲得牦牛AQP9基因的編碼區序列并首次通過生物信息學相關技術和方法發現該蛋白含有六次跨膜結構，屬于疏水性蛋白；二級結構由α-螺旋、延伸、β-折疊及無規則卷曲構成；牦牛AQP9蛋白與黃牛、藏羚羊、綿羊等物種間同源性較高，本研究將為牦牛低氧適應性研究提供一定的基礎資料。

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(編輯 郭云雁)

Cloning and Bioinformatics Analysis of the CDS of YakAQP9 Gene

LIU Jian-feng1，DING Yan-ping2，WU Zhi-wei3，WANG Jian-lin1，SHAO Bao-ping1*

(1.InstituteofZoologyandDevelopmentalBiology,SchoolofLifeSciences，LanzhouUniversity，Lanzhou730000，China；2.SchoolofLifeScience，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，China；3.InstituteofSystemsBiologyandTCMTransformation，GansuTraditionalChineseMedicalCollege，Lanzhou730020，China)

The aim of this study was to investigate the adaption mechanism of plateau animals to extreme environment of the Qinghai-Tibet plateau，and to provide some basic data for exploring the adaption mechanism of plateau animals.The coding region sequence of yakAQP9 was cloned by molecular cloning technique and analyzed by bioinformatics in this study.Some characteristics of theAQP9 gene and encoded protein sequences were predicted and analyzed in the following aspects as the general physical and chemical properties，hydrophobicity，transmembrane structure and secondary structure.The results showed that the CDS of yakAQP9 contains a complete ORF (885 bp) encoding 295 amino acids.The putative molecular weight and theory isoelectric point ofAQP9 gene coding protein in yak were 31.89 ku and 6.21，respectively.The protein encoded by yakAQP9 contains 6 transmembrane domains，and it was a hydrophobic protein.The secondary structures are mainly composed of α-helix，extended strand，β-turn and random coil.Deduced amino acid sequences ofAQP9 gene between yak and cattle，sheep and other species were high homology，and the phylogenetic distance consistent with their genetic relationship.This study will provide certain basic data for studying hypoxia adaptation of yak.

yak；Aquaporin9(AQP9)；gene；CDS region；molecular cloning；bioinformatics

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.008

2014-08-27

國家自然科學基金項目(青年基金：31000190；地區基金：31060141)；蘭州大學中央高校基本科研業務費專項

劉健鋒(1988-)，男，重慶忠縣人，碩士生，主要從事高原動物適應性機理研究，E-mail：andyandhope@gmail.com

*通信作者：邵寶平，博士，副教授，碩導，主要從事高原動物適應性機理研究，E-mail：shaobp@lzu.edu.cn

S823.8+5.2

A

0366-6964(2015)07-1134-07