細胞自噬對牛病毒性腹瀉病毒復制的影響

宮曉煒，鄭福英，陳啟偉，劉永生，李兆才，周繼章，才學鵬，殷 宏

(中國農業科學院 蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 草食動物細菌病創新團隊，蘭州 730046)

細胞自噬對牛病毒性腹瀉病毒復制的影響

宮曉煒，鄭福英，陳啟偉，劉永生*，李兆才，周繼章*，才學鵬，殷 宏

(中國農業科學院 蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 草食動物細菌病創新團隊，蘭州 730046)

本研究旨在了解牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)誘導的細胞自噬在病毒感染過程中所起的作用。用Oregon C24V株感染MDBK細胞，以Western blot、間接免疫熒光、透射電鏡三種方法鑒定細胞自噬的產生；通過自噬抑制藥物Wortmannin和自噬基因Beclin-1的RNAi干擾阻斷自噬，探究自噬對BVDV復制的影響。結果顯示，病毒感染可以引起LC3I向LC3Ⅱ的轉化及p62的降解；轉染GFP-LC3質粒的細胞，在病毒感染后出現增多的聚集顆粒；透射電鏡能觀察到細胞中出現大量的雙層膜結構；此外，抑制細胞自噬或干擾Beclin-1的表達，細胞上清中病毒的滴度及病毒蛋白質的表達量都有所降低。BVDV感染早期可以誘導自噬的產生，且自噬對病毒的復制有利。

牛病毒性腹瀉病毒；細胞自噬；病毒復制

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，為黃病毒科瘟病毒屬成員[1]。BVDV感染動物能引起以急慢性黏膜病、持續性感染和免疫抑制為主要特征的傳染性疾病[2]。近二十多年來，歐盟多個國家采取了凈化BVDV的措施，包括持續性感染動物的檢測和清除、疫苗保護性的提高及嚴格的生物安全操作，取得了不錯的效果，但流行病學調查數據顯示，BVDV感染在全球流行的形勢依然嚴峻，如亞洲、中歐、美洲等[3-6]。在中國，BVDV的流行也明顯呈上升趨勢[7-8]。目前，從宿主角度研究黃病毒科病毒致病機制的報道越來越多，但探索與BVDV復制相關的研究極為有限。

自噬是一種進化保守的細胞自救行為，對維持細胞穩態和應激條件下細胞的存活有重要意義[9]。目前已鑒定的自噬相關基因(ATGs)有36個，它們通過多種機制嚴格調控細胞自噬，包括自噬空泡和自噬溶酶體的形成[10]。而作為真核細胞早期的保護防御機制，細胞自噬可通過相應機制清除胞內病原體，水泡性口炎病毒(VSV)和裂谷熱病毒(RVFV)感染誘導的自噬能有效抑制病毒復制[11-12]。但也有許多病毒，如豬瘟病毒(CSFV)、柯薩奇病毒B3(CVB3)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型腦炎病毒(JEV)、登革熱病毒(DV)可進化出各種不同的機制來破壞、逃避和抑制細胞自噬，甚至會利用自噬來增強自身的繁殖能力[13-16]。

鑒于細胞自噬在病毒感染中的重要調節作用，本試驗用BVDV Oregon C24V感染MDBK細胞，檢測細胞內自噬空泡的形成及自噬相關蛋白質的表達；并通過影響自噬產生的信號通路，明確自噬與病毒復制之間的關系。

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞株

Oregon C24V毒株購于中國獸醫藥品監察所；MDBK細胞為筆者實驗室保存。

1.2 質粒和相關抗體

兔抗-LC3B多克隆抗體(Anti-LC3B antibody produced in rabbit，L7543)購自Sigma公司；兔源BECN1(H-300)抗體購自SANTA GRUZ公司；Anti-p62/SQSTM1購自MBL公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體和山羊抗兔IgG-HRP購自Earthox公司；羊抗兔IgG-TRITC抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司；兔抗Npro多克隆抗體、pEGFP-N1-LC3質粒為筆者實驗室制備。

1.3 相關試劑

雷帕霉素(Rapamycin，R0395)和Wortmannin(W1628)為Sigma公司產品；Trizol Reagent、脂質體2000(Lipofectamin 2000 Reagent)為Invitrigen公司產品；X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent為羅氏公司產品；OPTI-MEM培養基為Gibco公司產品；DAPI封片劑為Southern Biotech公司產品。

1.4 Western blot檢測LC3脂酰化及Npro蛋白的表達

1.4.1 接毒和細胞處理 將待接毒和處理的細胞鋪于細胞板，當細胞密度達80%～90%時，用感染復數MOI為1的BVDV感染MDBK細胞，37 ℃吸附2 h，然后棄掉含病毒的液體，加入完全培養基培養；在不同的時間點收取細胞；試驗中陽性對照組加入100 nmol·L-1的Rapamycin，陰性對照不感染BVDV。

1.4.2 細胞樣品制備及檢測 收集細胞沉淀，加入細胞裂解液混勻沉淀，冰上裂解40 min，12 000 r·min-1離心10 min后移出上清，進行SDS-PAGE電泳。轉膜后，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，兔抗-LC3B多克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗Npro多克隆抗體(1∶200稀釋)作為一抗37 ℃孵育2 h；山羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000稀釋)作為二抗37 ℃孵育45 min；最后利用ECL顯色液進行X光膠片曝光。

1.5 Wortmannin處理對LC3脂酰化及Npro蛋白表達的影響

將待接毒和處理的細胞鋪于細胞板，當細胞密度達80%～90%時，預先在培養基中添加100 nmol·L-1的Wortmannin，處理4 h，然后用感染復數MOI為1的BVDV感染MDBK細胞，37 ℃吸附2 h，棄掉含毒的液體，加入完全培養基培養；陽性對照組加入100 nmol·L-1的Rapamycin，陰性對照組接毒后不加Wortmannin；其余方法同1.4.2。

1.6 檢測GFP-LC3在細胞中的聚集

1.6.1 pEGFP-N1-LC3質粒的轉染 將待接毒和處理的細胞鋪于細胞板，細胞密度達80%～90%時，使用Lipofectamin 2000轉染試劑，按質粒∶Lipofectamin 2000 = 1∶2的比例進行轉染。

1.6.2 接毒和細胞的處理 Rapamycin陽性對照組：質粒轉染之前預先在培養基中添加100 nmol·L-1的Rapamycin，處理2 h后，用相同濃度的完全培養基培養；病毒感染組：待轉染質粒后24 h，細胞接毒；陰性對照組：單轉質粒的正常細胞。

1.6.3 間接免疫熒光檢測 pEGFP-LC3轉染后的細胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min；0.1%的Triton X-100透化15 min；10%的羊血清室溫封閉2 h；兔抗Npro多克隆抗體(1∶200稀釋)作為一抗37 ℃孵育2 h；羊抗兔IgG-TRITC(1∶100稀釋)作為二抗37 ℃孵育45 min；最后用DAPI染色并封片，并在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 透射電鏡觀察自噬體的形成

收集感染組、陰性和陽性對照組的細胞，用2.5%的戊二醛4 ℃固定4 h，1%的鋨酸室溫固定2 h，經乙醇梯度脫水和丙酮置換，對樣品進行包埋、修塊和切片；經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后在透射電鏡下進行觀察。

1.8 Western blot檢測p62的降解

方法同1.4.1，不感染病毒的細胞為陰性對照組；細胞樣品進行Western blot時，Anti-p62/SQSTM1(1∶1 000稀釋)作為一抗，山羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000稀釋)作為二抗。

1.9Beclin-1的干擾對LC3脂酰化及病毒復制的影響1.9.1Beclin-1的RNA干擾 所用Beclin-1的干擾性小RNA(siRNA)分子濃度為200 nmol·L-1，采用兩條Beclin-1干擾siRNA，其核苷酸序列：GAGCTTCAAGATTCTGGACCGTGT(siBeclin-1-1)和CACCATCCAGGAGCTCACAGCTC(siBeclin-1-2)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。轉染細胞時，按說明書推薦的比例，用相應體積的OPTI-MEM分別稀釋siRNA和X-tremeGENE siRNA Transfection regent，試驗中設置陰性對照組即轉染無序的siRNA；細胞接毒同方法1.4.1。

1.9.2 BVDV滴度的測定 用無血清的DMEM將病毒做連續10倍的稀釋，從10-1到10-10；接種96孔的細胞培養板中，每個稀釋度接種一縱排，共8個孔，每孔100 μL，最后兩縱排為正常細胞對照；逐日觀察細胞5～7 d并記錄細胞病變的結果，按Reed-Muench法計算病毒滴度。

1.9.3 Western blot檢測 方法同1.4.1，其中兔抗LC3多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗Beclin-1多克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗Npro多克隆抗體(1∶200稀釋)作為一抗，山羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000稀釋)作為二抗。

2 結 果

2.1 病毒感染對LC3脂酰化及Npro蛋白表達的影響

以自噬誘導劑Rapamycin誘導的細胞為陽性對照組，未處理的細胞為陰性對照組；用Oregon C24V毒株感染MDBK細胞，在感染后12、24、36 h分別收集細胞，檢測自噬蛋白LC3Ⅱ的表達，與陰性對照組相比，結果顯示(圖1)：BVDV感染細胞后24 h，形成脂酰化的LC3(LC3Ⅱ)，而在感染36 h，LC3Ⅱ的水平與對照組相比無差別，說明在BVDV感染早期，可以誘導細胞發生自噬。同時，用兔抗Npro多克隆抗體檢測病毒蛋白質表達的情況，發現LC3Ⅱ水平的增高與Npro蛋白的表達呈正相關。

圖1 Western blot檢測LC3I向LC3Ⅱ的轉化及Npro蛋白的表達Fig.1 Westen blot analysis of the coversion of LC3Ito LC3Ⅱ and expression of Npro

2.2 Wortmannin處理對LC3脂酰化及Npro蛋白表達的影響

從2.1結果中得知，病毒感染24 h可以誘導細胞自噬的產生，因此用Wortmannin處理細胞，結果表明(圖2)，處理后的細胞在BVDV感染24 h，LC3Ⅱ的含量明顯減少，說明Wortmannin的確阻斷了自噬的發生，而對應的Npro蛋白含量顯著降低，說明病毒的復制依賴細胞自噬的發生。

2.3 檢測EGFP-LC3在細胞中的聚集

pEGFP-N1/LC3瞬時轉染MDBK細胞，24 h后用Oregon C24V感染細胞；感染24 h后，通過熒光顯微鏡觀察EGFP熒光是否形成點狀分布。結果證明(圖3)，用Rapamycin處理的陽性細胞和BVDV感染的細胞中有EGFP-LC3點狀聚集，而在陰性處理組中EGFP熒光是呈彌散狀分布的；進一步證實，BVDV感染24 h可以促進細胞發生自噬。

圖2 Western blot檢測Wortamannin處理后LC3I向LC3Ⅱ的轉化及Npro蛋白的表達Fig.2 Westen blot analysis of the coversion of LC3Ito LC3Ⅱ and expression of Npro in the presence of Wortamannin

圖3 EGFP-LC3在感染細胞中的分布Fig.3 The redisturbution of EGFP-LC3 in BVDV-infected cells

2.4 透射電鏡觀察自噬體

為了在超微水平檢測自噬體的形成，利用透射電鏡對Rapamycin陽性對照組、病毒感染組和陰性對照組的細胞進行觀察；結果發現(圖4)，Rapamycin組和病毒感染組均能誘導細胞出現雙層膜的典型自噬體結構，如自噬體包裹溶酶體和線粒體(C、E)，自噬體與溶酶體融合(F)。而相比之下，陰性對照組的細胞質內未見到雙層膜的結構出現。

2.5 Western blot檢測p62的降解

p62/SQSTM1蛋白在細胞自噬過程中插入自噬小體，連接LC3和泛素化底物，隨后被自噬溶酶體降解。因此，p62的特異性降解代表了完整自噬的形成。通過Western blot檢測了BVDV感染過程中p62蛋白的水平；其中對照組的細胞培養24 h進行收集，試驗組分別在BVDV感染后 6、12和24 h收取樣品；結果表明(圖5)病毒感染24 h發生p62蛋白的降解，進一步證實BVDV感染增加了細胞的基本自噬，并誘導了自噬流量的產生。

2.6 Beclin-1的干擾對LC3脂酰化及病毒復制的影響 2.6.1 Beclin-1的RNA干擾 為進一步說明細胞自噬在BVDV復制中所起的作用，通過RNAi技術對Beclin-1基因進行了干擾，Western blot結果證實(圖6)，相比轉染無序siRNA的MDBK，設計的siRNA可以有效地干擾內源性Beclin-1蛋白的表達。

圖4 透射電鏡觀察細胞內自噬樣空泡的形成Fig.4 The autophagosome-like vesicle formation in MDBK cells observed by transmission electron microscope

圖5 BVDV感染MDBK細胞后誘導p62的降解Fig.5 Degradation of p62 in MDBK cell after BVDV infection

圖6 Western blot檢測RNA干擾的效果Fig.6 The silencing efficiency was detected by Western blot

2.6.2 Beclin-1的干擾對LC3脂酰化和Npro蛋白的影響 抑制內源性表達的Beclin-1，檢測病毒感染細胞中LC3Ⅱ的水平和病毒蛋白Npro的表達，結果顯示(圖7)RNAi可以降低LC3I向LC3Ⅱ的轉化和Npro蛋白的表達量，說明干擾自噬相關基因可以有效抑制BVDV蛋白的表達。

圖7 Beclin-1的干擾對LC3I向LC3Ⅱ的轉化及Npro蛋白表達的影響Fig.7 Impact of siBeclin-1 on the coversion of LC3Ito LC3Ⅱ and expression of Npro

2.6.3 Beclin-1的干擾對病毒滴度的影響 抑制內源性表達的Beclin-1，對MDBK細胞上清中的BVDV滴度進行了檢測，結果發現(圖8)與轉染無序siRNA的細胞相比，轉染siBeclin-1的細胞上清中病毒滴度下降2.13倍，說明干擾自噬相關基因可以有效抑制BVDV的復制。

*P<0.05圖8 Beclin-1的干擾對病毒滴度的影響Fig.8 Impact of siBeclin-1 on the virus titers

3 討 論

絕大多數RNA病毒在感染細胞之后可以引起自噬穩態的產生和自噬體的蓄積。自噬穩態檢測的方法主要包括Western blot檢測LC3的轉化、熒光顯微鏡觀察EGFP-LC3的分布及透射電鏡鑒定自噬體的形成[17]。本試驗以Oregon C24V毒株感染MDBK細胞，在不同時間點收取樣品，利用上述三種方法進行檢測，結果表明：LC3I向LC3Ⅱ發生了轉化，LC3Ⅱ的水平增高，表明前體LC3I與自噬體表面的磷脂酰肌醇相連，形成了脂酰化LC3Ⅱ；細胞質中，EGFP-LC3發出的熒光由彌散狀轉為顆粒狀，說明轉變的LC3Ⅱ定位在自噬體膜上；透射電鏡下可看到包裹細胞質成分和異物的雙層囊膜結構，以及正在發生融合的自噬體和溶酶體；這些均表明BVDV感染可以誘導自噬穩態的產生。值得注意的是，在試驗過程中，正常的細胞也會發生自噬，因此在細胞轉染、病毒感染及藥物處理后，均換成完全培養基進行細胞培養，以確保細胞生長的良好狀態。

自噬穩態的產生主要指細胞自噬誘導發生的起始階段，在自噬后期，自噬體需要和溶酶體融合發生降解，而判斷這一過程就看是否誘導了“自噬流量”的產生；p62/SQSTM1蛋白可以在后期形成自噬溶酶體時被溶酶體降解，因此對它進行檢測可以明確是否發生了完整的自噬[18]。本試驗表明p62在BVDV感染后24 h發生了降解，初步證明BVDV感染能誘導自噬流量的產生。自噬流量的增加更能反映出細胞內自噬發生的程度，新城疫病毒(NDV)可誘導自噬流量的增加，從而誘導完整的細胞自噬[19]；豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)通過抑制自噬體向溶酶體的降解，不能誘導自噬流量的產生，從而誘導不完全的自噬[20-21]。因此，要明確BVDV感染后細胞自噬發生水平的高低，還需要通過檢測溶酶體抑制后LC3Ⅱ的轉化試驗、EGFP-LC3和晚期溶酶體標記物LAMP1共定位試驗等進一步驗證。

很多研究表明細胞自噬參與病毒的復制過程，是一把“雙刃劍”；一方面可通過阻斷或誘導自噬體的形成限制病毒在細胞中的復制，另一方面病毒可利用自噬為自身服務。為了進一步探究自噬對BVDV復制的影響，我們通過添加自噬抑制藥物Wortmannin和干擾自噬關鍵基因Beclin-1的內源性表達來檢測細胞內病毒蛋白質的表達和病毒滴度的變化。Wortmannin可通過阻斷ClassI和ClassⅢ PI3K途徑抑制早期自噬體的形成[22]，Western blot結果證實抑制自噬可以降低病毒蛋白質Npro的表達。據報道，瘟病毒屬病毒的Npro蛋白不僅參與病毒粒子的包裝，而且在病毒復制過程中也起關鍵作用[23]。此外，干擾Beclin-1的表達也有效抑制了Npro蛋白的表達和細胞上清中BVDV滴度；從而說明Beclin-1在BVDV的復制感染中起關鍵的作用，細胞自噬的誘導能夠促進病毒的增殖。

最近，S.Shrivastava等證明，黃病毒科成員丙型肝炎病毒(HCV)可誘導自噬以增加自身的復制，更重要的是，HCV引發的自噬可以抑制干擾素的表達[24]。BVDV是一種免疫抑制性疾病，可影響宿主IFN的生成，能在機體內持續性感染，然而BVDV在復制的時候是如何調控自噬通路的，又是如何利用自噬逃避宿主免疫防御系統的，還有待于進一步研究。

4 結 論

BVDV感染早期可以誘導MDBK細胞發生自噬，并且自噬在BVDV的復制中發揮有利的作用。

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(編輯 白永平)

Impact of Cellular Autophagy on Bovine Viral Diarrhea Virus Replication

GONG Xiao-wei，ZHENG Fu-ying，CHEN Qi-wei，LIU Yong-sheng*，LI Zhao-cai，ZHOU Ji-zhang*，CAI Xue-peng，YIN Hong

(StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology，BacterialDiseaseinGrazingAnimalTeam，LanzhouVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730046，China)

The objective of this study was to investigate the role of cellular autophagy in bovine viral diarrhea virus (BVDV) infection.We used Oregon C24V strain to determine whether BVDV infection induced autophagy by using western blot，indirect immunofluorescent assay and transmission electron microscopy.To analyze the effect of autophagy on the replication of BVDV in MDBK cell，wortmannin and small interfering RNAs targeting Beclin-1 were used to inhibit autophagy.The results showed that BVDV infection results in LC3-I/Ⅱ conversion，p62 degradation，an increased accumulation of punctate GFP-LC3-expressing cells，and a higher number of autophagosome-like double-membrane vesicles in the cytoplasm of host cells.Inhibition of autophagy or interfering expression of Beclin-1 led to a significant reduction in BVDV titers and protein expression.These results demonstrate that BVDV infection induces autophagy which in turn enhances BVDV replication.

bovine viral diarrhea virus；cellular autophagy；virus replication

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.017

2014-10-10

國家肉牛產業技術體系項目(CARS-38)

宮曉煒(1982-)，女，甘肅蘭州人，助理研究員，博士，主要從事動物疫苗與分子免疫學研究，Tel：0931-8342673，E-mail：gongxiaowei@caas.cn

*通信作者：劉永生，主要從事細菌病致病機制及防控技術研究，E-mail：liuyongsheng@caas.cn；周繼章，主要從事動物疫苗及分子免疫學研究，E-mail：zhoujizhang@126.com

S852.659.6

A

0366-6964(2015)07-1201-07