貂源偽狂犬病病毒的分離鑒定及gE基因分子特征

芮 萍，劉曜綜，馬增軍，王秋悅，楊彩然，劉謝榮

（河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室，秦皇島066004）

偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV），又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科。PRV具有廣泛的宿主譜，豬是主要貯存宿主和傳染源。PRV主要引起家畜和多種野生動物出現以發熱、奇癢、呼吸和神經系統疾病為特征的急性傳染病［1－3］。自2011 年以來，在四川、黑龍江、吉林、江蘇等地許多使用基因缺失活疫苗免疫的規模化豬場出現了PR流行，同時在不同地區分離出了PRV變異株［4－8］。與此同時，PRV不僅在本地區豬群中蔓延，在家養毛皮動物中普遍發生疑似偽狂犬病，呈現地區性暴發趨勢，造成了巨大的經濟損失。病毒感染狐、貂、貉表現持續搔癢、自咬、興奮不安、神經麻痹、消瘦、腹瀉、失明或呼吸困難等癥狀。甚至有些狐、貂并無明顯臨床癥狀，突然死亡。

為了證實流行疫病為偽狂犬病毒感染所致，本試驗通過對疑似偽狂犬病病料處理、病毒分離鑒定、PRVgE基因擴增與序列分析，為認識貂源流行病毒分子特征、疫情的防控以及疫苗研究提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 病料、細胞及實驗動物

腦組織病料來源于河北省昌黎縣某水貂飼養場，表現為興奮不安、尖叫、腹瀉等疑似偽狂犬癥狀的病死成年水貂。MDCK細胞由河北省預防獸醫學重點實驗室保存；家兔由河北科技師范學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，DMEM培養基為GIBCO產品，胎牛血清為WISENT產品，LaTaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture、2×GC BufferⅡ購自TaKaRa生物科技（大連）有限公司。

1.3 病毒基因組的提取及PCR擴增

以組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取核酸。參照文獻方法合成引物，PCR擴增［9］。

1.4 病毒分離與純化

將PCR鑒定為陽性的腦組織勻漿液，采用0.22 μm濾器過濾除菌后接種MDCK單層細胞進行培養，并觀察細胞病變（CPE）。待CPE達80%左右時收毒，凍融后取上清。將收獲的病毒液經過3輪空斑純化后接種MDCK細胞，收獲病毒液凍存于－70℃。

1.5 病毒粒子的電鏡觀察

取MDCK細胞中培養的第3代病毒液用2%磷鎢酸負染，在電鏡下觀察病毒粒子形態。

1.6 免疫熒光鑒定（IFA）

將分離病毒接種6孔板中的MDCK細胞，24h后棄培養液，以預冷的丙酮固定30min，分別加1∶200稀釋的一抗500μL，37℃孵育1h，用GFP標記兔抗豬二抗37℃孵育1h，置熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.7 動物接種試驗

將經純化后的病毒液按1∶100稀釋后接種2只家兔，每只皮下注射1mL，另2只對照家兔分別注射1mL DMEM維持液。

1.8 gE基因序列分析

以提取的病毒分離株細胞培養物的DNA為模板，對gE基因進行PCR擴增，并將擴增產物克隆至pGM－T載體中進行序列測定。利用DNAS－tar7.1生物學分析軟件進行分析。

2 結 果

2.1 病料樣品檢測

將疑似偽狂犬病貂的腦組織勻漿后提取DNA，用gE特異性引物進行PCR檢測。結果擴增出約1 700bp的DNA片段（圖1），表明送檢樣品為PRV陽性。

圖1 貂腦組織樣品gE基因PCR鑒定Fig.1 PCR amplification of PRV gEfragments from mink brain sample

2.2 病毒的分離及鑒定

將陽性腦組織勻漿液過濾除菌后接種MDCK單層細胞，盲傳至第2代時，在接毒后20h產生明顯CPE（圖2），可見細胞膨大變圓，失去光澤，形成合胞體，部分細胞開始出現折光性增強，48h后90%細胞脫落。利用gE特異性引物對培養物進行PCR鑒定，能夠擴增到預期片段。將F3代培養物負染后進行電鏡檢測，可以觀察到病毒粒子近似球形，直徑150～180nm，有囊膜，且囊膜上有凸起（圖3）。將分離毒株命名為Mink 1。

圖2 病料腦組織勻漿上清液感染MDCK細胞引起的細胞病變Fig.2 Cytopathogenic effects of MDCK cells inoculated with homogenated brain tissue supernatant

圖3 病毒粒子的電鏡觀察 （Bar＝100nm）Fig.3 The morphology of virus particles under electron microscope（Bar＝100nm）

2.3 IFA鑒定

分離病毒感染MDCK細胞后，用PRV陽性血清做IFA檢測。如圖4所示，病毒感染能產生典型合胞體病變，合胞體能與PRV陽性血清作用，顯示強烈熒光，這證實分離病毒確為PRV。

圖4 病毒的間接免疫熒光檢測結果Fig.4 IFA identification of the isolated virus

2.4 動物接種試驗

家兔接種病毒后于58h出現興奮不安、陣發性抽搐，撕咬接種部位，繼而出現前肢麻痹，在接種后60h角弓反張死亡。注射DMEM培養液的對照家兔無任何臨床癥狀。

2.5 病毒核酸gE全基因擴增及系統發育分析

采用PCR擴增完整的gE基因編碼區，克隆于pGM－T中進行測序，獲得1 757bp基因片段。對gE核苷酸序列與其他毒株序列進行比對，結果發現，Mink 1基因序列與國內外其他對應序列相比有5個獨特的核苷酸突變，第96位（G→T）、136位（T→C）、317位（T→C）、943位（G→C）、1 052位（G→A），另外，還有6處突變與2012年之后國內分離株普遍存在的突變位點相同，分別是142－144位GAC插入，161位G→A，228位C→A，1 343位G→A，1 487－1 490位ACG插入，1 535位G→A。核苷酸序列相似性分析結果表明Mink 1株與其他毒株gE基因相似性為97.1%～99.4%，與XiangA株和ZM株相似性最高，為99.4%。Mink 1株和部分2012年新分離的毒株位于一個相對獨立的分支中，而與以前分離的毒株親緣關系相對較遠，系統進化樹見圖5。

圖5 系統進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis

3 討 論

本研究通過采集疑似偽狂犬病水貂病料，將PCR檢測陽性病料接種MDCK細胞，并通過電鏡形態和免疫熒光觀察，初步證實從發病水貂腦組織中分離出1株PRV野毒株。將經蝕斑純化后的病毒液接種家兔，試驗組家兔在接種病毒后出現明顯的偽狂犬癥狀，皮膚瘙癢，用嘴啃咬注射部位，興奮不安，繼而出現四肢麻痹，最終角弓反張死亡。

由于目前缺乏對貂偽狂犬病的詳細描述資料，該病常被誤診為鏈球菌性腦炎、犬瘟熱和細小病毒性腸炎。PRV基因組GC含量高達70%，設計檢測病毒的PCR引物難度較大，有時造成檢測樣品不夠敏感，確診該病最有力的證據仍是分離獲得病毒。在病料的檢測過程中，發現腦組織的病毒含量高，應盡量以發病貂的腦組織作為檢測材料。

對gE基因的進化分析發現，Mink 1分離毒株gE基因與國內外其他豬源參考毒株gE基因相似性在97%以上，與2012年新近分離的豬源偽狂犬病毒株遺傳關系近，位于一個相對獨立的分支中，與以前分離的毒株遺傳關系較遠。盡管這些病毒株能否形成一個新的流行毒株群還有待更多的分子流行病學數據來驗證。但可以推斷，當前本地區流行的貂源PRV可能由豬源PRV變異毒株而來，這與對犬的相關報道相似［10］。序列突變分析顯示，Mink 1同時存在142—144位GAC和1 487—1 490位ACG兩處特征性插入，并在1 535位、161位、228位等11處發生點突變。這些插入或點突變是否與病毒毒力增強有關，其功能有待進一步研究。此外，除gE基因外的其他PRV基因是否發生了更多突變，從而使其得以在不同宿主間傳播也需要更進一步的研究探索。

近年來，偽狂犬病病毒呈現變異速度加快、毒力增強、跨種感染增多的趨勢。在狐、貉、貂等毛皮動物飼養較密集的區域，大量出現偽狂犬病臨床癥狀為主要表現的病癥，且呈暴發流行趨勢。據病史調查，病獸既有生食豬、牛、羊等動物產品的病史，也有無生食動物產品病史；有的毛皮動物養殖場毗鄰豬場，有的距離養豬場較遠，因此，感染途徑除了經消化道感染以外，不排除通過空氣傳播豬源PRV的可能性。因此，毛皮動物養殖場應距離豬場較遠些，平時要做好隔離消毒措施。同時要加強豬偽狂犬病的防疫，是有效防控毛皮動物偽狂犬病的重要措施。

4 結 論

首次報道從發病水貂中分離鑒定PRV，并對其gE基因序列進行測定，經電鏡形態、免疫熒光觀察，以及PCR檢測證實分離到病毒，命名為 Mink 1。gE基因進化分析表明，該毒株與2012年以來豬偽狂犬變異株的相似性高達99.4%，位于一個相對獨立的分支。

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