聚醚醚酮種植材料TiO2顆粒噴砂處理的生物活性研究

吳曉綿，胡小蕾，鄧 鋒

（1.重慶醫科大學口腔醫學院/口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室/重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶401147；2.重慶醫科大學附屬口腔醫院正畸科，重慶400015；3.重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學重點實驗室，重慶400016）

聚醚醚酮種植材料TiO2顆粒噴砂處理的生物活性研究

吳曉綿1，2，胡小蕾3，鄧 鋒1，2

（1.重慶醫科大學口腔醫學院/口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室/重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶401147；2.重慶醫科大學附屬口腔醫院正畸科，重慶400015；3.重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學重點實驗室，重慶400016）

目的探討TiO2顆粒噴砂處理聚醚醚酮（PEEK）的最佳粒度范圍。方法用5種粒度范圍的TiO2顆粒（A～E組）對PEEK進行噴砂處理，進行表面粗糙度檢測，觀察細胞黏附、細胞增殖、細胞形貌，并檢測堿性磷酸酶（ALP）活性。結果PEEK的表面粗糙度隨著噴砂TiO2顆粒的粒度增大而增加。同時發現了多個峰值的存在，細胞黏附實驗OD值的峰值出現在C組（180～212 μm TiO2顆粒進行噴砂），數值為0.566 2。經過14 d培養，成骨細胞ALP活性峰值出現在D組（＞212～355 μm TiO2顆粒進行噴砂）。結論PEEK表面噴砂的最佳TiO2顆粒粒度范圍為180～355 μm，可為今后PEEK表面改性研究提供重要參考。

骨和骨組織； 生物力學； 生物相容性材料； 堿性磷酸酶； 二氧化鈦； 聚醚醚酮

經過長期的臨床檢驗和分析，發現鈦和鈦合金存在離子析出，并且與骨組織力學性能不匹配，這成為種植體周圍無菌性骨吸收和種植體失敗的主要原因[1-2]。與金屬和其他高分子種植體相比，聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）與骨組織力學性能更加匹配[1，3]。PEEK被認為是金屬種植體最重要的替代材料之一，然而PEEK的生物惰性限制了它的生物學應用[3]。表面粗糙度被認為是生物材料生物活性最重要的參數之一[4]。多種方法被用于金屬種植體表面的改性，噴砂處理是其中被廣泛應用的一種[1-3]。TiO2具有優越的生物活性和穩定性。有報道證實，對鈦種植體在骨皮質內穩定最好的TiO2噴砂顆粒的粒度范圍是180～212 μm[5]。作者對PEEK進行TiO2顆粒噴砂處理表面改性的最佳粒度范圍進行了研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 試劑與材料 根據前期研究利用Al2O3對PEEK復合物噴砂處理的實驗結果[6]，以及利用TiO2顆粒對鈦表面進行噴砂的最佳粒度范圍（180～212 μm）[5]，將本研究進行噴砂處理的TiO2顆粒分成A、B、C、D、E五組，顆粒分別為：75～96，＞96～109，180～212，＞212～355，＞355～500 μm（圖1）。PEEK粉末從Victrex（UK）獲得。成骨細胞系MG 63從ATCC（American type culture collection）獲得，培養于含雙抗的MEM培養基中。掃描電鏡型號為日本HitachiS-4800，噴金機為英國Quorum 550X，機械形貌儀為美國Dektek8 Stylus Profiler，Veeco。WST-1購于德國RocheDiagnostics，堿性磷酸酶試劑盒購于BioChain，蛋白濃度試劑盒購于美國Sigma。

1.2 方法 PEEK粉末在華東理工大學教育部醫用生物材料工程研究中心采用壓縮成型法進行樣品制備。樣品被切割成圓片狀（Ф 15 mm×2 mm）進行表征和體外實驗。樣品打磨到2000號進行表面均一化，用機械形貌儀檢測的Ra值和Rg值。粗糙度Ra在0.1 μm以下的樣品被收集起來。進行噴砂的時候圓盤到噴嘴的距離為10 mm，TiO2顆粒流擊打圓盤樣品表面的角度為90°，而氣流的壓力設定為0.5 MPa。在經過噴砂過后，樣品用超聲清潔儀器在去離子水中進行清潔。樣品再用表面形貌儀進行檢測粗糙度。

圖1 制備的不同粒徑的噴砂用TiO2顆粒

在24孔板中，在具有不同粗糙度PEEK表面，以1 ×105/孔的最終細胞濃度進行培養，經過4 h培養后，移除細胞培養液，用PBS沖洗PEEK樣品3次以去除沒有黏附的細胞，用WST-1的MEM培養基檢測黏附細胞的活力。成骨細胞MG63被種在PEEK的圓片上，在經過不同的培養時間（3、7、14 d后），用含有4%戊二醛固定，乙醇梯度脫水，烘箱中干燥，噴金機對樣品進行噴金，再用掃面電鏡進行細胞形貌觀察。將成骨細胞培養在PEEK表面，分別在培養3、7、14 d后用含WST-1的MEM培養液檢測細胞增殖活性。經過14 d的培養后，用Triton X-100裂解細胞，再用堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測成ALP活性，并用蛋白濃度試劑盒檢測總蛋白作為參比。

1.3 統計學處理 所有的數據利用OriginPro 8 SR3統計軟件（OriginLab Corporation，Northampton，MA），計量資料以±s表示；數據采用方差分析進行統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PEEK表面粗糙度 隨著顆粒TiO2粒度的增大而增加，見表1。Ra值從A組的（1.20±0.15）μm增長到E組的（3.15±0.47）μm，而Rq值從A組的（1.50±0.15）μm增長到E組的（3.96±0.69）μm。

2.2 細胞黏附 經過4 h培養，OD值從A組（0.496 2± 0.046 9）增加到C組（0.566 2±0.020 7），再從C組減少到E組（0.497 8±0.044 2）（圖2），在C組存在一個OD峰值，而且C組OD值與A、B、E組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 細胞形貌觀察 培養3、7、14 d后，細胞固定，并用SEM觀察（圖3）。經過3 d培養，成骨細胞MG 63在C組顯得更加緊貼PEEK表面，看起來更加平坦。而在E組的成骨細胞顯得更加成梭形。

表1 經過噴砂后5種樣品的表面粗糙度（±s，μm）

表1 經過噴砂后5種樣品的表面粗糙度（±s，μm）

組別A組B組Ra Rq C組 D組E組1.20±0.15 1.50±0.15 2.40±0.56 2.70±0.59 3.15±0.47 1.50±0.15 1.92±0.24 2.94±0.68 3.41±0.87 3.96±0.69

圖2 5種PEEK材料的細胞黏附能力檢測

圖3 經過3、7、14 d培養后的成骨細胞在5種PEEK表面的細胞形貌

2.4 細胞增殖活性檢測 在具有不同粗糙度的PEEK表面，經過3 d的短期培養，細胞的增殖和活性差異無統計學意義（P＞0.05）。但是經過7 d的長期培養，C組（PEEK圓盤狀樣品用180～212 μm粒度的TiO2進行噴砂處理）的成骨細胞WST-1檢測的OD值明顯強于B組（PEEK圓盤狀樣品用96～109 μm粒度的TiO2顆粒進行噴砂）（P＜0.05）。經過14 d培養，五組的OD值均隨著TiO2顆粒的粒度增加而增加（P＜0.05）。見圖4。

圖4 經過3、7、14 d培養后的成骨細胞MG63細胞增殖情況

2.5 ALP活性 經過14 d培養，ALP活性隨著TiO2顆粒的增加而增加（圖5）。從A組增加到D組，E組則較D組下降。在D組存在著峰值。

圖5 經過14 d培養后的成骨細胞ALP活性檢測

3 討 論

盡管大量研究報道了PEEK復合材料表面粗糙度能夠增強PEEK復合物的生物活性，但是TiO2噴砂處理對PEEK骨結合的最佳粒度范圍不明確[6]。本研究的目的是找出TiO2顆粒的最佳范圍，為后續研究提供理論依據。經過噴砂處理過后PEEK的表面粗糙度隨著TiO2顆粒的粒度增大而增加（表1）。經過在具有不同粗糙度的PEEK表面培養4 h，成骨細胞在C組（由180～212 μm TiO2顆粒進行噴砂處理）培養細胞黏附能力顯著增高（圖2）。經過7 d的培養，在C組的成骨細胞增殖活性顯著增強（圖4）。經過14 d的培養，成骨細胞的增殖隨著表面粗糙度的增加而增加（圖4）。經過14 d的培養，成骨細胞MG 3的ALP活性在D組出現峰值（圖5）。

種植體表面形貌和化學組成是其生物活性和骨結合的關鍵[7-8]。本研究中，PEEK的表面粗糙度隨著TiO2顆粒的粒度增大而增加（表1）。這個跟先前報道的鈦表面噴砂研究結果吻合。改善牙科和外科種植體生物活性的一種可能方法就是增加其表面粗糙度[9-11]。本研究關注TiO2噴砂作用的效果，而純的噴砂粗糙化的PEEK表面元素并沒有改變。

PEEK被證明是一種惰性材料，而這一特性并不利于其快速的骨結合[1，12]。本研究主要致力于找出對PEEK進行TiO2噴砂的最佳粒度范圍。經過在PEEK粗糙表面4 h培養，C組顯示出最大的OD峰值（圖2），經過7 d的培養，成骨細胞在C組顯示出最大的OD值（圖4）。而經過14 d的培養，成骨細胞在D組展現出最高的ALP活性（圖5）。用于TiO2顆粒進行鈦表面噴砂的制備微米粗糙度對種植體在骨皮質中保持穩定的最佳的顆粒粒度為180～212 μm[5]。而本研究發現，對PEEK進行噴砂的最好TiO2粒度范圍存在C組180～212 μm和D組＞212～355μm。

從粗糙度的角度來看，種植體粗糙度Ra的范圍應該在1～4 μm[1，8]。有報道對種植體的粗糙度進行了分級，Ra＜0.2 μm被認為是光滑的，3～4 μm被認為是粗糙的，＞6 μm被認為是很粗糙的，本研究中所有組介于中度粗糙到粗糙之間，而且全部在1～4 μm。經過3 d培養，在具有中度粗糙度的PEEK表面（圖3，C組）成骨細胞細胞形貌顯得更加平坦，在具有粗糙的PEEK表面（圖3，E組）顯得更加呈現為梭形。經過14 d的培養，細胞增殖實驗檢測結果OD值提示，隨著TiO2顆粒粒度的增加OD值也隨著增加（圖4）。這可能是因為PEEK表面越粗糙，能夠提供給細胞生長的空間越大。

表面化學組成和形貌對種植的骨結合來說非常重要。多種研究制備了旨在改善PEEK生物活性的PEEK復合物。經過對PEEK表面的化學組成進行了改善，但是這些研究對PEEK表面粗糙度的關注并不多。本研究用五組不同粒度的TiO2顆粒對PEEK進行噴砂處理，并且找出實驗結果的多個峰值。這些結果提示，在應用于牙科和外科方面，用TiO2顆粒對PEEK進行噴砂處理存在最佳的粒度范圍應該是180～355 μm。

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Studyon bioactivity of implant material polyether-ether-ketone processed by TiO2particles blasting

Wu Xiaomian1，2，Hu Xiaolei3，DengFeng1，2
（1.Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences/ChongqingMunicipalKeyLaboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education/College of Stomatology，Chongqing Medical University，Chongqing 400871，China；2.Department of Orthodontics，Stomatological Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400015，China；3.Key Laboratory of Clinical Laboratory Science，Ministry of Education，College of Laboratory Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing400016，China）

ObjectiveTo find out the best granularity range of TiO2particles blasting process on polyether-ether-ketone（PEEK）.MethodsFivekindsofgranulerangeofTiO2particles（group A-E）were utilized forconducting the surface blasting process on PEEK.The surface roughness was tested，the cell attachment，cell proliferation and cell morphology were observed and alkalinephosphatase（ALP）activitywasdetected.ResultsTheroughnessofblasted PEEKsurfacewasincreased astheincreaseofTiO2particles granularity.At the same time several peak values were found.In the cell attachment test，the peak OD value appeared in the group C（blasting by 180-212 μm of TiO2particles），which was 0.566 2.After 14 d culture，the peak value of osteoblast ALP activity appeared in the group D（blasting by＞212～355 μm of TiO2particles）.ConclusionThe best granularity range of TiO2particles for PEEK surface blasting is 180-355 μm，which can provide an important reference for the future study of PEEK surface modification in thefuture.

Bone and bones； Biomechanics； Biocompatible materials； Alkaline phosphatase； TiO2；Polyetheretherketone

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.12.001

:A

:1009-5519（2015）12-1761-03

2015-03-05）

國家自然科學基金青年基金（31400808）；國家自然科學基金面上項目（81271183）。

吳曉綿（1982-），男，廣東揭陽人，講師，主治醫師，主要從事口腔醫學的臨床、科研與教學;E-mail：wuxiaomian898@163.com。

鄧鋒（E-mail：deng63@263.net）。