WNT5B在乳腺癌中的表達及意義

劉洪濤，周凡涵，申媛媛，張艾潔，賴艷梅，厲紅元(重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科，重慶400016)

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WNT5B在乳腺癌中的表達及意義

劉洪濤，周凡涵，申媛媛，張艾潔，賴艷梅，厲紅元△
(重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科，重慶400016)

［摘要］目的:研究WNT5B在乳腺癌中的表達，初步探討WNT5B與乳腺癌臨床病理特征的關系。方法:采用real-time PCR和Western blot法檢測67例乳腺癌及癌旁組織中WNT5B在mRNA和蛋白水平的表達情況，通過免疫組織化學方法檢測WNT5B在乳腺癌和癌旁組織中的表達并分析WNT5B的表達與相關臨床病理指標之間的關系。結果: 67例乳腺癌組織標本中均有不同程度WNT5B的mRNA及蛋白表達，且WNT5B在乳腺癌組織的表達明顯低于癌旁組織(P＜0.05) ;其中WNT5B在原發性腫瘤大小T≤20 mm的乳腺癌患者中的表達明顯高于其在T＞20 mm組患者中的表達(P＜0.05) ; WNT5B的表達與乳腺癌患者腋窩淋巴結轉移情況、組織學分級、相關的免疫組織化學指標(ER、PR、c-ErBb-2、p53和Ki-67)之間無明顯的相關性(P＞0.05)。結論: WNT5B在乳腺癌組織中的表達低于癌旁組織，WNT5B表達與乳腺癌患者原發腫瘤大小呈負相關，提示WNT5B可能作為乳腺癌預后的一個新的分子標志物，為乳腺癌的診治提供新的思路。

［關鍵詞］WNT5B表達;乳腺癌

［修回日期］2015-04-15

Expression of WNT5B in breast cancer and its clinical significance

LIU Hong-tao，ZHOU Fan-han，SHEN Yuan-yuan，ZHANG Ai-jie，LAI Yan-mei，LI Hong-yuan
(Department of Endocrinology and Breast Surgery，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.E-mail: hongy_li@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the expression of WNT5B in the breast cancer and further to discuss the correlation between WNT5B and clinicopathologic characteristics of breast cancer.METHODS: The expression of WNT5B at mRNA and protein levels was measured by real-time PCR and Western blot in 67 cases of breast cancer and the tissue adjacent to carcinoma.In addition，the immunohistochemical method was used to detect the expression of WNT5B in the breast cancer and the tissue adjacent to carcinoma.The relationships between WNT5B expression and clinicopathologic indexes were also analyzed.RESULTS: The expression of WNT5B in the breast cancer was obviously lower than that in the tissue adjacent to carcinoma (P＜0.05).The expression of WNT5B at mRNA and protein levels in 67 samples of breast cancer was in various degrees.The expression of WNT5B in T≤20 mm group of human breast cancer was obviously higher than that in T＞20 mm group (P＜0.05).The expression of WNT5B had no obvious correlation with axillary lymph node metastasis，histological grade and immunohistochemical indexes of ER，PR，c-ErBb-2，p53 and Ki67 (P＞0.05) in the breast cancer.CONCLUSION: The expression of WNT5B decreases obviously in breast cancer.The expression of WNT5B is related to primary tumor size，which provides new ideas for the diagnosis and treatment of breast cancer，suggesting that WNT5B may be a new molecular marker for prognosis of breast cancer.

［KEY WORDS］WNT5B expression; Breast cancer

乳腺癌是嚴重影響女性身心健康的惡性腫瘤之一，近年我國乳腺癌發病率逐年增長，位居女性惡性腫瘤首位［1-2］。目前信號通路途徑治療惡性腫瘤是生物治療的新興領域，Wnt信號家族與乳腺癌密切相關，高達60%的乳腺癌患者Wnt蛋白過度表達［3-4］，在促進腫瘤的發生、發展發揮關鍵作用［5-6］。WNT信號通路功能廣泛、機制復雜，WNT5B作為WNT通路眾多配體之一，以旁分泌或自分泌的方式參與非經典WNT通路，參與胚胎發育時期細胞命運和組織分化類型的調控以及腫瘤的發生［7-8］。研究顯示，WNT5B在惡性骨肉瘤、肝癌及結腸癌中高表達，且與腫瘤的惡性程度及轉移能力密切相關［8-11］，提示WNT5B可能是潛在的腫瘤相關基因。本研究擬通過檢測乳腺癌和乳腺癌旁組織中WNT5B表達情況并觀察分析其與臨床病理指標的關系，旨在初步探討WNT5B與乳腺癌發生、發展的作用，為尋找乳腺癌新的靶點和判斷預后提供理論依據。

材料和方法

1標本來源

收集2013年10月～2014年5月在重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科手術切除乳腺癌組織及距離癌灶5 cm以上癌旁組織標本各67例，年齡30～80歲，平均年齡49歲。經術后病理診斷證實為乳腺癌，所有患者均為女性且未行術前放、化療及免疫治療。所有標本在離體后30 min內立即放入經DEPC水處理后的凍存管置于液氮保存，部分標本以4%多聚甲醛保存。

2主要試劑和儀器

TRIzol總RNA提取試劑(Invitrogen) ;逆轉錄試劑盒、real-time PCR試劑盒和DNA Marker (TaKaKa) ; SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑和II抗(北京中杉公司) ;鼠抗人WNT5B單克隆抗體(Santa Cruz) ; real-time PCR儀(ABI) ;自動酶標儀(Thermo) ;凝膠成像系統(Bio-Rad)。

3方法

3.1免疫組化(SP法)檢測WNT5B蛋白的表達

標本經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規制備免疫組織化學石蠟切片，免疫組化用SP法檢測。置67℃恒溫烤箱烘烤2 h后，石蠟切片經脫蠟，抗原修復血清封閉，加鼠抗人WNT5B抗體(滴度1∶100)置4℃孵育過夜，37℃復溫后反復PBS清洗;加生物素標記(滴度1∶1 000免疫組化試劑)，37℃孵育15 min;加辣根過氧化物酶標鏈霉菌抗生物素蛋白工作液;顯微鏡下控制DAB顯色，清洗后，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠液封片，鏡下觀察結果。光鏡下細胞質內出現棕色顆粒表示WNT5B免疫反應呈陽性，無棕色顆粒出現為陰性。每張切片由2名病理醫師在雙盲法下進行判定。

3.2 Real-time PCR檢測WNT5B mRNA的表達冰凍組織按TRIzol總RNA提取試劑說明書操作。取等量RNA模板加樣，使用逆轉錄試劑盒將按說明書操作完成逆轉錄后，得到cDNA第1鏈。以β-actin為內參照。WNT5B的上游引物為5’-AAATGCCACGGCGTCTCG-3’，下游引物為5’-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3’，擴增片段為163 bp;β-actin的上游引物為5’-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游引物為5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’，擴增片段為315 bp。PCR反應體系為10 μL體系: SYBR@Premix Ex TaqTM5 μL，上、下游引物各0.1 μL，無酶水3.8 μL，cDNA 1 μL。反應條件為95℃預變性3 min;95℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，39個循環;65℃延伸15 s。采用2－ΔΔCt法計算以β-actin表達量為基準的WNT5B基因相對值作為統計數據。

3.3 Western blot檢測WNT5B蛋白的表達取勻漿器碾碎組織后加細胞裂解液、PMSF和Cocktail提取組織總蛋白。酶標儀檢測蛋白濃度，取相同質量蛋白加入上樣緩沖液100℃煮沸變性10 min，配置10%分離膠進行SDS-PAGE，4℃冷庫內100 V 100 min恒壓將蛋白印記電轉至PVDF轉印膜上，5%脫脂奶粉PBST液封閉1 h;鼠抗人WNT5B單克隆抗體(1∶1 000) 4℃冷庫孵育過夜;取出PVDF轉印膜室溫下PBST反復清洗3次，每次約10 min;加羊抗鼠II抗(1∶1 000)室溫孵育40 min; PVDF轉印膜室溫下PBST反復清洗3次，每次約10 min;取化學發光反應試劑盒中A液和B液等體積混合，加混合液到PVDF膜上暗室進行化學發光反應。暗室膠片曝光。使用Quantity One軟件分析各個樣本，分別測量各組中不同基因的灰度值，以β-actin灰度值為基準，WNT5B/β-actin的相對值作為統計數據。

4統計學處理

使用SPSS 19.0軟件進行數據處理和分析檢驗，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組數據間比較行t檢驗，3組數據間比較行單因素方差分析和SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 SP法檢測WNT5B在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

對所收集的67對乳腺癌及相對應的癌旁組織進行組織固定、包埋、切片，經免疫組化染色發現，WNT5B主要位于細胞胞質中。在癌旁組織和乳腺癌組織中WNT5B表達率分別為78.6%和21.4%。WNT5B蛋白在乳腺癌組織中的表達量低于癌旁組織(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of WNT5B detected by the method of immunohistochemistry in breast cancer and the tissue adjacent to cancer (×100).圖1 WNT5B在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達

2 Real-time PCR檢測WNT5B在乳腺癌組織和癌旁組織中mRNA的表達水平

WNT5B mRNA在乳腺癌組織和癌旁組織中均有表達，且癌組織中表達量明顯低于癌旁組織(P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of WNT5B in the breast cancer and the tissue adjacent to cancer.Mean±SD.n=20.＊＊P＜0.01 vs adjacent group.圖2 WNT5B mRNA在乳腺癌及其癌旁組織中的表達

3 Western blot檢測WNT5B蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

通過Western blot法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中WNT5B蛋白的表達情況，結果顯示WNT5B蛋白在乳腺癌組織中表達量明顯低于癌旁組織(P＜0.05)，見圖3。

4 WNT5B在乳腺癌中表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

經統計學分析顯示，WNT5B mRNA及蛋白在乳腺癌中的表達與腋窩淋巴結轉移、不同激素受體(EP、PR)狀況、c-ErBb-2、p53、Ki67表達情況和組織學分級間無顯著差異(P＞0.05) ;在腫瘤大小T≤20 mm組中顯著增高(P＜0.05)，見表1、2。

Figure 3.The protein levels of WNT5B in breast cancer and the tissue adjacent to cancer.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs adjacent group.圖3 WNT5B蛋白在乳腺癌及其癌旁組織中的表達

表1　 WNT5B mRNA及蛋白表達與乳腺癌組織學分級之間的關系Table 1.The expression of WNT5B at mRNA and protein levels in breast cancer and their relationships with the histological grade of breast cancer (Mean±SD)

討論

WNT5B主要位于細胞胞質內，參與胚胎發育和多種疾病發生的病理過程［12-13］，Bradley等［7］研究發現在骨肉瘤細胞中WNT5B通過抑制JNK信號的中斷影響軟骨細胞的增殖與遷移，Kato等［14］在人肺癌A549細胞和人胰腺癌Panc-1細胞中的研究發現，WNT5B參與了上皮細胞向間質細胞的轉化，進而影響腫瘤細胞的侵襲能力，促進腫瘤的惡性增長，提示WNT5B對腫瘤細胞的增殖、遷移、分化等過程起著重要作用，而WNT5B在乳腺癌的發生發展中是否具有同樣重要作用尚不清楚;本研究在此基礎上，針對手術切除乳腺癌組織及癌旁正常組織標本各67例，通過real-time PCR、免疫組織化學染色和Western blot法分別在mRNA和蛋白水平檢測WNT5B在乳腺癌組織及癌旁組織的表達情況，發現在WNT5B乳腺癌和癌旁組織均有表達，且癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，提示我們WNT5B在乳腺癌組織中呈低表達。

進一步與臨床病理特征比對分析發現WNT5B表達與腋窩淋巴結轉移、EP、PR、Her2、p53、Ki67表達情況、組織學分級之間無明顯相關性，而在原發性腫瘤大小T≤20 mm的乳腺癌患者中的表達明顯高于其在T＞20 mm組患者中的表達，即乳腺癌T1期組患者中WNT5B表達明顯高于T2期和T3期，提示WNT5B與乳腺癌原發腫瘤大小呈負相關，而腫瘤大小與腫瘤的惡性程度和治療效果及預后生存情況密切相關，提示乳腺癌組織中低水平表達的WNT5B可能參與了腫瘤的發生、發展，其具體機制有待我們進一步探索。

綜上所述，WNT5B在乳腺癌和癌旁組織中的表達存在顯著差異，與乳腺癌原發腫瘤大小呈負相關，這一發現可為乳腺癌的臨床治療方案選擇及預后判定提供一定的理論依據，對乳腺癌的預防與治療具有重要意義。

表2　 WNT5B mRNA及蛋白表達與乳腺癌患者相關臨床病理指標的關系Table 2.The expression of WNT5B at mRNA and protein levels in breast cancer and their relationships with clinicopathologic characteristics of breast cancer (Mean±SD)

［參考文獻］

［1］Roy C，Choudhury KB，Saha A，et al.Metaplastic carcinoma of the breast: a case report with review of literature ［J］.Indian J Cancer，2014，51(3) :381-383.

［2］袁磊，李伯和，時冉冉，等.沉默JAG1基因對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2014，30(2) : 262-267.

［3］Brennan KR，Brown AM.Wnt proteins in mammary development and cancer［J］.J Mammary Gland Biol Neoplasia，2004，9(2) :119-131.

［4］Brown AM.Wnt signaling in breast cancer: have we come full circle［J］.Breast Cancer Res，2001，3(6) : 351-355.

［5］李海英，張力，潘歡樂，等.Wnt信號通路在食管癌細胞放射抗拒性形成中的作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28(9) :1623-1626.

［6］Nusse R.The Wnt gene family in tumorigenesis and in normal development［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，1992，43(1-3) : 9-12.

［7］Bradley EW，DrissI MH.WNT5B regulates mesenchymal cell aggregation and chondrocyte differentiation through the planar cell polarity pathway［J］.J Cell physiol，2011，226(6) :1683-1693.

［8］Willert K，Brown JD，Danenberg E，et al.Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors ［J］.Nature.2003，423(6938) :448-452.

［9］Morioka K，Tanikawa C，Ochi K，et al.Orphan receptor tyrosine kinase ROR2 as a potential therapeutic target for osteosarcoma［J］.Cancer Sci，2009，100 (7) : 1227-1233.

［10］Sun D，Qin L，Xu Y，et al.Influence of adriamycin on changes in Nanog，Oct-4，Sox2，ARID1 and Wnt5b expression in liver cancer stem cells［J］.World J Gastroenterol，2014，20(22) :6974-6980.

［11］劉偉，周兵，張紅，等.Wnt-5b在結腸癌中的表達及對結腸癌細胞的影響［J］.生命科學研究，2013，17(5) :427-430.

［12］Saitoh T，Katoh M.Molecular cloning and characterization of human WNT5B on chromosome 12p13.3 region［J］.Int J Oncol，2001，19(2) :347-351.

［13］Saitoh T，Katoh M.Expression and regulation of WNT5A and WNT5B in human cancer: up-regulation of WNT5A by TNFα in MKN45 cells and up-regulation of WNT5B by β-estradiol in MCF-7 cells［J］.Int J Mol Med，2002，10 (3) :345-349.

［14］Kato S，Hayakawa Y，Sakurai H，et al.Mesenchymaltransitioned cancer cells instigate theinvasion of epithelial cancer cells through secretion of WNT3 and WNT5B［J］.Cancer Sci，2014，105 (3) :281-289.

通訊作者△Tel: 023-89011496; E-mail: hongy_li@ hotmail.com

［收稿日期］2014-12-15

［文章編號］1000-4718(2015)06-1032-04

［中圖分類號］R730.23

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.012