脂多糖持續(xù)刺激巨噬細(xì)胞的免疫學(xué)機(jī)制初探*

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脂多糖持續(xù)刺激巨噬細(xì)胞的免疫學(xué)機(jī)制初探*

龍?jiān)树耄惙f，余汝媛，汪洋△
(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命與健康工程研究院，廣東廣州510632)

［摘要］目的:探討巨噬細(xì)胞在脂多糖(LPS)的持續(xù)刺激下產(chǎn)生免疫抑制后的表型變化及對(duì)T細(xì)胞影響的分子機(jī)制。方法:蔗糖密度梯度離心法從全血中分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，結(jié)合磁珠細(xì)胞分選技術(shù)分選出單核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，以未處理和IFN-γ處理為對(duì)照，對(duì)LPS處理48 h的巨噬細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞表面分子(HLA-DR、CD14、CCR7、HLA-ABC及CD40)表達(dá)的檢測(cè)和細(xì)胞因子(IL-10、IL-12、IL-6及TNF-α)分泌水平的檢測(cè)。同時(shí)將LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞與CD3+T細(xì)胞進(jìn)行異體共培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖能力的影響。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路中的非MyD88依賴型途徑相關(guān)分子的表達(dá)水平。結(jié)果: LPS處理48 h的巨噬細(xì)胞，抗原遞呈能力(HLA-DR)下降，免疫抑制細(xì)胞因子IL-10升高，把LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞與異體T細(xì)胞共培養(yǎng)6 d，其促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖的能力較弱。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示LPS持續(xù)刺激下巨噬細(xì)胞的TRIF、IRF3和CIITA均呈下調(diào)狀態(tài)。結(jié)論:持續(xù)LPS處理巨噬細(xì)胞48 h后，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)一種免疫抑制的狀態(tài)，且其刺激CD8+T細(xì)胞增殖的能力減弱，這種狀態(tài)與非MyD88依賴型TLR4信號(hào)通路受損有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］巨噬細(xì)胞;脂多糖;免疫抑制表型; Toll樣受體4

［修回日期］2015-05-04

Immunological mechanism of long-term stimulation by LPS in macrophages

LONG Yun-lin，CHEN Ying，YU Ru-yuan，WANG Yang
(Institutes of Life and Health Engineering，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: 373506762@ qq.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the molecular mechanism and the immunosuppressive phenotype of macrophages under long-term exposure to lipopolysaccharide (LPS).METHODS: We used Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation combined with MicroBeads Separation Kits to separate peripheral blood mononuclear cells from human blood，and then induced the monocytes into macrophages.We observed the morphology of the macrophages by treating the cells with LPS for 48 h，in comparison with a negative control and IFN-γ treatment.ELISA was used to detect the levels of cytokines，such as IL-10，IL-12，IL-6 and TNF-α，and flow cytometry was used to detect the expression of the surface molecules (HLA-DR，CD14，CCR7，HLA-ABC and CD40).To observe the effect of macrophage on T cell proliferation，co-culture experiment was carried out for 6 d.Real-time PCR was used to validate the expression levels of molecules related to MyD88-independent pathway in Toll-like receptor 4 (TLR4) signal pathway.RESULTS: The antigen-presenting ability of the macrophages was reduced and the IL-10 expression level was increased after the cells were treated with LPS for 48 h.We observed a poor proliferative capacity of CD8+T cells after co-culturing of LPS-induced macrophages with CD3+T cells for 6 d.The results of real-time PCR indicated that TRIF，IRF3 and CIITA were down-regulated in LPS-induced macrophages.CONCLUSION: We successfully established a macrophage model in vitro and observed that LPS-induced macrophages into an immunosuppressive phenotype with poor CD8+T cell proliferative capacity，in which MyD88-independent TLR4 signaling pathway was impaired.

［KEY WORDS］Macrophage; Lipopolysaccharides; Immunosuppressive phenotype; Toll-like receptor 4

巨噬細(xì)胞(macrophage，Mφ)由骨髓前體細(xì)胞分化而來(lái)，作為抗原遞呈細(xì)胞，它在固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)均發(fā)揮關(guān)鍵作用［1-2］。作為一種可塑性極強(qiáng)的調(diào)節(jié)細(xì)胞，它參與機(jī)體各種功能調(diào)控，如宿主細(xì)胞防御調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和免疫功能調(diào)節(jié)等［2-3］。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要組成部分。它不僅可在宿主機(jī)體抗擊病原體時(shí)引發(fā)急性免疫反應(yīng)，還可以幫助建立適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在自然界中，不同細(xì)菌的LPS的具體結(jié)構(gòu)和組成有差異，用不同細(xì)菌來(lái)源的LPS刺激巨噬細(xì)胞后，雖然免疫應(yīng)答有差異，但是總體趨勢(shì)是一致的。另外，作為T(mén)oll樣受體(Toll-like receptor，TLR)的配體，LPS既可誘導(dǎo)細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex)的表達(dá)上調(diào)，又能促進(jìn)免疫耐受細(xì)胞因子(如IL-10)的分泌，并且抑制調(diào)節(jié)型T細(xì)胞［4］。

已經(jīng)有報(bào)道觀察到生物體在受LPS刺激后，當(dāng)二次刺激時(shí)會(huì)通過(guò)下調(diào)TLR4(Toll-like receptor 4，TLR4)而實(shí)現(xiàn)LPS耐受這一現(xiàn)象［5］。TLR4通路是生物體固有免疫系統(tǒng)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的主要受體，其啟動(dòng)的信號(hào)通路還能調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答［6］，它被分為髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴和MyD88非依賴途徑。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)MyD88缺陷小鼠對(duì)LPS刺激幾乎沒(méi)有反應(yīng)，說(shuō)明TLR4-MyD88通路是LPS反應(yīng)所必須的。

在腸道微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞在外來(lái)抗原的持續(xù)刺激下產(chǎn)生的免疫耐受，其分泌及對(duì)T細(xì)胞的效應(yīng)發(fā)生何種變化且這些變化的分子機(jī)理仍需進(jìn)一步探索。因此，本研究進(jìn)一步探討人巨噬細(xì)胞在LPS持續(xù)刺激下產(chǎn)生免疫抑制后的表型變化及其對(duì)T細(xì)胞的影響。

材料和方法

1細(xì)胞和樣本血液

人血液樣本及相應(yīng)細(xì)胞取自廣東省血液中心。

2主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、非必需氨基酸、HEPES、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、CFSE細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen; LPS、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、青霉素和鏈霉素購(gòu)自Sigma;粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)和CD3單克隆抗體(Orthoclone OKT3)購(gòu)自PeproTech;人白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)和人白細(xì)胞介素10 (interleukin-10，IL-10)均為BioLegend產(chǎn)品;人白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)購(gòu)自達(dá)科為公司。

人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津川頁(yè)生物制品公司;人Monocyte Isolation Kit II和CD3/CD14/CD4 MicroBeads購(gòu)自美天妮; RT reagent Kit為T(mén)aKaRa產(chǎn)品; SsoFast EvaGreen Supermix為Bio-Rad產(chǎn)品; microElute Total RNA Kit購(gòu)自O(shè)mega。

藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標(biāo)記的人CD163抗體(PE-CD163)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的人CD206抗體(FITC-CD206)、PE-CD14抗體、Alexa488-CD86抗體、PE-CD4抗體、FITC-HLA-DR抗體、PE-CD25抗體和PE-CD69抗體均購(gòu)自BioLegend。

其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。所用引物由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。

表1　引物序列Table 1.Sequences of the primers

3主要方法

3.1從人的外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)根據(jù)正常人外周血血紅細(xì)胞和白細(xì)胞的沉降速度不同，通過(guò)自然沉降先把外周血白細(xì)胞層分離出來(lái)，在有抗凝劑的試管中混勻，37℃靜置60 min，懸液可分3層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細(xì)胞，在緊貼紅細(xì)胞層上有一呈灰白色的白細(xì)胞層，吸出白細(xì)胞層，按1∶1的比例用含有1%肝素鈉的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋;再用人淋巴細(xì)胞分離液，通過(guò)Ficoll-hypaque密度梯度離心法從白細(xì)胞層中分離得到單個(gè)核細(xì)胞，用PBS重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)單個(gè)核細(xì)胞的得率。

3.2從單個(gè)核細(xì)胞中用磁珠分選單核細(xì)胞(負(fù)選)

將得到的單個(gè)核細(xì)胞懸液在4℃、300×g離心10 min，去掉上清;每30 μL Running Buffer重懸1×107細(xì)胞，加入10 μL FcR Blocking Reagent抗體封閉，加入10 μL Biotin-Antibody Cocktail抗體，4℃均勻孵育10 min;然后加入Running Buffer，再加入20 μL的Anti-Biotin MicroBeads輕柔混勻，4℃均勻孵育15 min;加入1mL Running Buffer稀釋后4℃、300×g離心除去上清;用Running Buffer重懸細(xì)胞后加到洗滌好的磁珠柱子中分離，收集穿透液，離心得到單核細(xì)胞(monocyte)，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，通過(guò)流式檢測(cè)分析分選純度。

3.3體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞把分選得到的monocyte按1×106cells/well鋪至24孔板，每孔用1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10% Human AB血清，1%雙抗，10 mol/L Hepes，1×非必需氨基酸，1 mol/L丙酮酸鈉，2 mol/L L-谷氨酰胺)，外加20 μg/L的MCSF刺激5 d。培養(yǎng)16 h后，用含0.1% FBS的PBS輕柔地洗滌細(xì)胞1次，然后繼續(xù)用新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d(含20 μg/L MCSF)。5 d后，單核細(xì)胞分化至巨噬細(xì)胞狀態(tài)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

3.4巨噬細(xì)胞與異體淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)5 d的巨噬細(xì)胞加入特定的刺激(LPS/IFN-γ/LPS+ IFN-γ) 48 h后，把富集好的CD3+T細(xì)胞按巨噬細(xì)胞∶T細(xì)胞比例為1∶5的細(xì)胞數(shù)量比進(jìn)行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)基為含10%人血清的RPMI-1640，并加入0.1 U/L的IL-2和100 μg/L的OKT3。共培養(yǎng)5 d后，輕柔吸取培養(yǎng)上清，收獲半貼壁的T細(xì)胞，流式上機(jī)分析。

3.5 CFSE染色細(xì)胞增殖檢測(cè)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)及細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-10的ELISA檢測(cè)根據(jù)試劑盒中提供的實(shí)驗(yàn)操作方法進(jìn)行檢測(cè)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，對(duì)照組與其它各組比較采用LSD法，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 LPS刺激的巨噬細(xì)胞(LPS-Mφ) 48 h后抗原遞呈能力下降

建立巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)模型。首先用PE抗人CD14流式抗體檢測(cè)分離得到純度較高的單核細(xì)胞，圖1A中單核細(xì)胞純度從分離前的13.3%達(dá)到分離后的95%，表明單核細(xì)胞被成功富集。其次將分離出來(lái)的單核細(xì)胞經(jīng)過(guò)MCSF誘導(dǎo)分化形成巨噬細(xì)胞。

為了研究LPS刺激對(duì)巨噬細(xì)胞的影響，我們選取人類(lèi)抗原遞呈能力相關(guān)分子HLA-DR、HLAABC［7］及免疫反應(yīng)能力的相關(guān)分子表面抗原CD40、CC類(lèi)趨化因子受體7(chemokine CC motif receptor 7，CCR7)進(jìn)行檢測(cè)。圖1B和圖1C中LPS-Mφ的HLA-DR表達(dá)下調(diào)，表明巨噬細(xì)胞經(jīng)過(guò)LPS刺激48 h后抗原遞呈能力下降，而作為同樣的炎癥因子IFN-γ-Mφ卻無(wú)明顯變化。CD14和CD40分別作為單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物也未出現(xiàn)明顯變化。巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)在趨化因子CC配體21 (chemokine CC motif ligand 21，CCL21)的招募下能進(jìn)入淋巴結(jié)與T細(xì)胞相互作用受CCR7的依賴［8］。此處LPS-Mφ的CCR7表達(dá)下調(diào)，間接表明LPS-Mφ響應(yīng)CCL21的召募參與免疫反應(yīng)的能力減弱。

2 LPS長(zhǎng)時(shí)間刺激的巨噬細(xì)胞無(wú)凋亡發(fā)生

為了驗(yàn)證LPS處理后巨噬細(xì)胞的功能減弱不是由于LPS引起巨噬細(xì)胞凋亡所致，我們對(duì)LPS及IFN-γ處理過(guò)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-PI凋亡檢測(cè)。從圖2可知，由LPS及IFN-γ長(zhǎng)時(shí)間刺激的巨噬細(xì)胞并無(wú)凋亡發(fā)生，說(shuō)明了LPS-Mφ的HLA-DR與CCR7的表達(dá)下調(diào)不是由于凋亡所致。

3不同時(shí)點(diǎn)LPS-Mφ的細(xì)胞表面分子HLA-DR和CCR7的動(dòng)態(tài)變化

體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞至巨噬細(xì)胞至第5天時(shí)，用LPS和IFN-γ分別刺激巨噬細(xì)胞0 h～48 h，分別收集0 h、4 h、24 h和48 h時(shí)點(diǎn)的巨噬細(xì)胞，流式檢測(cè)其表面分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。如圖3所示，受LPS刺激的巨噬細(xì)胞，在0 h～4 h，HLA-DR有所升高，24 h后漸降，表明抗原遞呈能力是一個(gè)先升后降的動(dòng)態(tài)變化。而IFN-γ-Mφ卻是一直上升，CCR7也有與HLA-DR相類(lèi)似的結(jié)果，說(shuō)明促炎癥因子IFN-γ能持續(xù)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗原遞呈能力，而持續(xù)的LPS誘導(dǎo)卻能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞抗原遞呈能力下降。

4不同時(shí)點(diǎn)LPS-Mφ分泌的細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化

Figure 1.The continuous stimulation of LPS decreased the antigen-presenting ability of macrophages (Mφ).A: Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation separated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from blood and anti-CD14 MicroBeads Separation Kits was used to enrich the monocytes from PBMC.B: the monocytes were induced into Mφ and then treated with LPS or IFN-γ for 48 h.Antigen presentation-associated markers HLA-ABC，HLA-DR and CCR7 were detected.CD14 and CD40 were used as markers for monocytes and Mφ.C: the mean fluorescent intensity (MFI) of B was measured by flow cytometer.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs LPS-Mφ.圖1 LPS持續(xù)刺激巨噬細(xì)胞后導(dǎo)致抗原遞呈能力下降

巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)都會(huì)伴隨細(xì)胞因子分泌的變化，為了進(jìn)一步研究LPS刺激后不同時(shí)點(diǎn)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是否有對(duì)應(yīng)的變化情況，我們將巨噬細(xì)胞用LPS和IFN-γ處理后收集其上清，用ELISA方法檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞因子IL-10、IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌變化。結(jié)果顯示: LPS-Mφ分泌的IL-10從4 h至24 h一直升高，IFN-γ-Mφ則保持低下，表明48 h的LPS-Mφ是巨噬細(xì)胞的一種免疫抑制亞型。LPS-Mφ分泌的IL-1β和TNF-α從4 h至48 h先升后降，IFN-γ-Mφ則一直保持在較低水平，在48 h處上調(diào)。LPS-Mφ和IFN-γ-Mφ分泌的IL-6的變化規(guī)律與前幾種細(xì)胞因子的變化不一樣。以上結(jié)果表明同為促炎癥因子的IFN-γ和LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激后卻有著不同的表型變化及分子機(jī)理，短時(shí)間的LPS刺激能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)，而持續(xù)刺激卻誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫抑制，見(jiàn)圖4。

Figure 2.The continuous stimulation of LPS and IFN-γ for 24 h did not induce apoptosis of macrophages.圖2巨噬細(xì)胞在LPS和IFN-γ刺激24 h后無(wú)凋亡發(fā)生

Figure 3.The dynamic changes of HLA-DR and CCR7 of macrophages treated with LPS or IFN-γ from 0 h to 48 h.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs LPS-Mφ.圖3不同刺激時(shí)間LPS-Mφ和IFN-γ-Mφ的HLA-DR和CCR7的動(dòng)態(tài)變化

5排除IL-10自分泌引起HLA-DR的高表達(dá)

LPS處理后巨噬細(xì)胞的IL-10的表達(dá)水平持續(xù)升高，表示IL-10可能存在自分泌的形式抑制巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答。為了驗(yàn)證得到免疫抑制亞型的可靠性，需要排除HLA-DR的表達(dá)下調(diào)是來(lái)自內(nèi)分泌的IL-10作用。我們利用anti-IL-10R特異性結(jié)合細(xì)胞外的IL-10，從而阻止IL-10的自分泌途徑。圖5中，在巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基加入不同濃度的IL-10細(xì)胞因子，48 h后流式檢測(cè)，100 μg/L的IL-10會(huì)引起HLADR的表達(dá)下調(diào)，用5 mg/L的anti-IL-10R抗體進(jìn)行封閉，可見(jiàn)HLA-DR表達(dá)上升，封閉效果明顯。即使在封閉了IL-10的情況下，LPS-Mφ的HLA-DR下調(diào)且不能恢復(fù)。這結(jié)果說(shuō)明LPS-Mφ引起HLA-DR低表達(dá)并不是由于巨噬細(xì)胞自分泌IL-10所引起的，而是由于LPS本身刺激作用所產(chǎn)生的。

6 LPS-Mφ對(duì)T細(xì)胞增殖的影響

在機(jī)體環(huán)境中，巨噬細(xì)胞能夠遞呈抗原激活T細(xì)胞，而處于免疫抑制的巨噬細(xì)胞卻不能實(shí)現(xiàn)抗原遞呈［9］。經(jīng)過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)確實(shí)表明LPS的持續(xù)刺激確實(shí)能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制表型，于是我們進(jìn)一步探索LPS的持續(xù)刺激能否抑制巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的作用。我們先利用淋巴細(xì)胞分離液結(jié)合CD3+T細(xì)胞磁珠正選試劑盒，從人外周血分離得到純度較高的CD3+T細(xì)胞，再用抗人的CD3流式抗體檢測(cè)其純度，可達(dá)97%左右，見(jiàn)圖6。

我們以DC作為陽(yáng)性對(duì)照，把不同處理的巨噬細(xì)胞和DC分別與CD3+T按1∶5混合培養(yǎng)，6 d后流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞的CFSE熒光強(qiáng)度和CD4［T細(xì)胞是由CD4陽(yáng)性的輔助性T細(xì)胞(helper T cell，簡(jiǎn)稱(chēng)Th細(xì)胞)和CD4陰性、CD8陽(yáng)性的T殺傷細(xì)胞組成］的表達(dá)情況，進(jìn)而觀察LPS處理后的巨噬細(xì)胞是否對(duì)T細(xì)胞有激活效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況來(lái)評(píng)價(jià)其活化程度。如圖6所示，巨噬細(xì)胞與CD3+T細(xì)胞相互作用都能夠激活并促進(jìn)其增殖，而LPS-Mφ刺激CD4－/CD8+T細(xì)胞增殖為24%，比Medium-Mφ(40%)和IFN-γ-Mφ(50%)少。綜上所述，LPS-Mφ刺激CD8+T細(xì)胞的增殖能力較弱。此處DC作為一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，旨在更好地說(shuō)明不同條件下的刺激對(duì)T細(xì)胞的促增殖情況。

7 LPS持續(xù)刺激導(dǎo)致TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)受損

進(jìn)一步探索LPS持續(xù)刺激導(dǎo)致巨噬細(xì)胞免疫抑制的分子機(jī)理，已經(jīng)有文獻(xiàn)表明LPS導(dǎo)致巨噬細(xì)胞免疫抑制的原因是通過(guò)下調(diào)TLR4通路而實(shí)現(xiàn)的，由于TLR4信號(hào)通路分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性通路兩種，我們對(duì)MyD88非依賴途徑的相關(guān)調(diào)控分子TRIF、IRF3、CIITA和SATA1進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，結(jié)果表明這4個(gè)調(diào)控因子的表達(dá)均降低。說(shuō)明LPS持續(xù)刺激巨噬細(xì)胞是通過(guò)損傷非依賴于MyD88的TLR4信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)免疫抑制的，見(jiàn)圖7。

Figure 4.The dynamic change of IL-10，IL-6，TNF-α and IL-1β secretion in macrophages treated with LPS or IFN-γ from 0 h to 48 h.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs LPS-Mφ.圖4不同刺激時(shí)間LPS-Mφ和IFN-γ-Mφ的IL-10、IL-6、TNF-α和IL-1β分泌的動(dòng)態(tài)變化

Figure 5.LPS decreased HLA-DR expression in macrophages not through IL-10 paracrine pathway.圖5 IL-10受體封閉后LPS刺激巨噬細(xì)胞的HLA-DR表達(dá)情況以及不同濃度IL-10對(duì)巨噬細(xì)胞HLA-DR表達(dá)的影響

討論

1在對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激中，LPS和IFN-γ的作用效果不同

在免疫系統(tǒng)中，正常巨噬細(xì)胞是一種多功能的免疫細(xì)胞，在天然免疫中發(fā)揮吞噬病原體和分泌炎性因子的作用，又可以作為抗原遞呈細(xì)胞在獲得性免疫中活化T淋巴細(xì)胞。巨噬細(xì)胞對(duì)于炎癥刺激的反應(yīng)一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)，其分子機(jī)制也得到很好的闡述。已經(jīng)有報(bào)道表明在小鼠腹腔注射LPS之后，第2次注射小鼠機(jī)體會(huì)產(chǎn)生免疫抑制［9-10］，并且這種抑制是通過(guò)下調(diào)TLR4信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的［5］，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索LPS導(dǎo)致巨噬細(xì)胞免疫抑制后對(duì)T細(xì)胞的影響及其分子機(jī)理。我們對(duì)巨噬細(xì)胞刺激48 h后，LPS-Mφ的HLA-DR降低，IL-10升高，表明抗原遞呈能力減弱，推斷細(xì)胞處于一種免疫抑制狀態(tài)。由于LPS-Mφ在48 h分泌的IL-10升高，不可避免地會(huì)聯(lián)想到是否由于IL-10的自分泌作用于巨噬細(xì)胞，使其HLA-DR表達(dá)下降，基于此思考，我們的研究中用IL-10R封閉實(shí)驗(yàn)排除了此點(diǎn)疑慮。另外凋亡實(shí)驗(yàn)也表明LPS導(dǎo)致的HLA-DR的下調(diào)不是由于LPS誘導(dǎo)凋亡導(dǎo)致。

Figure 6.The continuous stimulation of LPS on macrophages decreased the proliferation of CD4－/CD8+T cells in co-culture.A: anti-CD3 MicroBeads Separation Kits was used to enrich the CD3+T cells from PBMC by flow cytometer; B: macrophages were treated with LPS or IFN-γ and co-cultured with CD4－/CD8+T cells for 6 d，then the proliferation of T cells was determined by CFSE assay; C: DC was set as a positive control as compared to macrophages.圖6 LPS刺激后的巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的增殖影響

2 LPS刺激體現(xiàn)的是先激活后抑制的動(dòng)態(tài)變化

CCR7是淋巴細(xì)胞和DC等遷移進(jìn)入次級(jí)淋巴器官T細(xì)胞區(qū)域的主要調(diào)節(jié)者，在這里表達(dá)升高間接表明巨噬細(xì)胞響應(yīng)趨化因子分泌，一定程度上表明巨噬細(xì)胞的活化程度。LPS刺激在0 h、4 h、24 h 和48 h過(guò)程中，HLA-DR和CCR7表現(xiàn)為先升后降，在前24 h，巨噬細(xì)胞響應(yīng)LPS的刺激，HLA-DR和CCR7升高，但從24 h開(kāi)始，它們二者開(kāi)始下降。這種結(jié)果表明，LPS在24 h內(nèi)的刺激會(huì)激活巨噬細(xì)胞，但超過(guò)24 h的刺激后，巨噬細(xì)胞逐漸產(chǎn)生一種免疫抑制表型。

3 LPS導(dǎo)致巨噬細(xì)胞抗原遞呈能力下降及TLR4信號(hào)受阻

LPS-Mφ與CD3+T細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中，CD4+T細(xì)胞的增殖并未受到LPS-Mφ的影響，LPS-Mφ僅對(duì)CD8+T細(xì)胞的促增殖能力較弱。表明LPS長(zhǎng)時(shí)間刺激巨噬細(xì)胞能夠抑制機(jī)體內(nèi)部殺傷性T細(xì)胞的增殖，降低機(jī)體對(duì)病原體的防御。

為了驗(yàn)證LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫抑制表型的產(chǎn)生機(jī)制，有文獻(xiàn)表明LPS是一個(gè)經(jīng)典的與TLRs的配體［11］且會(huì)引起免疫反應(yīng)，于是我們?cè)赗NA水平上驗(yàn)證了MyD88依賴和非依賴的2條經(jīng)典TLR4的信號(hào)通路。此外，MyD88非依賴途徑在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞缺損中響應(yīng)TLR的研究亦有報(bào)道［12］。我們?cè)诰奘杉?xì)胞中驗(yàn)證了IFR3/STAT1信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)IFR3的表達(dá)顯著下降，而且，它們的直接下游調(diào)控蛋白CIITA也顯著下調(diào)，此蛋白直接調(diào)控MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)［13］。結(jié)合前面的結(jié)果，提示LPS-Mφ的HLA-DR表達(dá)下降，有可能激活的是IFR3信號(hào)通路的MyD88非依賴途徑。

綜上所述，本研究進(jìn)一步闡明了持續(xù)的LPS刺激能夠通過(guò)阻礙巨噬細(xì)胞的TLR4信號(hào)通路，從而促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制表型，減弱了巨噬細(xì)胞對(duì)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的活化及促增殖作用。在機(jī)體環(huán)境受到外來(lái)病原體入侵或者腫瘤發(fā)生時(shí)，DC和巨噬細(xì)胞都有著抗擊腫瘤、病原體和抗原遞呈的作用，成熟DC已經(jīng)在多種癌癥中被作為細(xì)胞免疫治療的疫苗［14-16］，然而，與DC有相同祖先的巨噬細(xì)胞，它的抗原遞呈能力和激活T細(xì)胞的信號(hào)能力卻甚少有人關(guān)注。本研究進(jìn)一步探索巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答分子機(jī)理，為抗炎癥及抗腫瘤藥物研發(fā)提供依據(jù)。

Figure 7.The continuous stimulation of LPS impaired TLR4 pathway in an MyD88-independent manner in macrophages.Macrophages were treated with LPS for 48 h and then the mRNA levels of TRIF，CIITA，IRF3 and MyD88 were detected by real-time PCR.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs 4 h;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 24 h.圖7 LPS持續(xù)刺激能損傷非MyD88依賴性的TLR4信號(hào)通路

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通訊作者△Tel: 020-85227039; E-mail: 373506762@ qq.com

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家973項(xiàng)目(No.2011CB910701) ;教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(No.20104401120008)

［收稿日期］2015-03-10

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1048-09

［中圖分類(lèi)號(hào)］R392.32

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.015